Введение

Класс ферментов

Целлюлаза (; систематическое название 4 β-D-глюкан 4-глюканогидролаза) – любой из нескольких ферментов, производимых главным образом грибами, бактериями и простейшими, которые катализируют целлюлолиз, распад целлюлозы и некоторых связанных с ней полисахаридов:

Эндогидролиз (1→4) β-D-гликозидных связей в целлюлозе, лихенине и зерновых β-D-глюкане.

Название также используется для любой природной смеси или комплекса различных таких ферментов, которые действуют последовательно или синергически для разложения целлюлозного материала. Целлюлазы расщепляют молекулу целлюлозы на моносахариды ("простые сахара"), такие как β-глюкоза, или более короткие полисахариды и олигосахариды. Расщепление целлюлозы имеет значительное экономическое значение, поскольку делает основную составляющую растений доступной для потребления и использования в химических реакциях. Специфической реакцией является гидролиз 1,4 β-D-гликозидных связей в целлюлозе, гемицеллюлозе, лихенине и зерновых β-D-глюканах. Поскольку молекулы целлюлозы сильно связываются друг с другом, целлюлолиз относительно затруднен по сравнению с расщеплением других полисахаридов, таких как крахмал. Большинство млекопитающих обладают лишь очень ограниченной способностью переваривать пищевые волокна, такие как целлюлоза, самостоятельно. У многих травоядных животных, таких как жвачные, например крупный рогатый скот и овцы, и животных с ферментацией в задней части кишечника, например лошадей, целлюлазы производятся симбиотическими бактериями. Эндогенные целлюлазы производятся несколькими видами животных, такими как некоторые термиты, улитки и дождевые черви. Недавно целлюлазы были обнаружены и в зеленых микроводорослях (Chlamydomonas reinhardtii, Gonium pectorale и Volvox carteri), а их каталитические домены (CD), принадлежащие к семейству GH9, демонстрируют наибольшую гомологию последовательности с метазоанными эндогенными целлюлазами. Целлюлазы водорослей являются модульными, состоящими из предполагаемых новых богатых цистеином углеводных связывающих модулей (CBM), богатых пролином/серином (PS) линкеров, а также предполагаемых Ig-подобных и неизвестных доменов у некоторых представителей. Целлюлаза из Gonium pectorale состоит из двух CD, разделенных линкерами и с C-концевой CBM. Известно несколько различных типов целлюлаз, которые отличаются по структуре и механизму действия. Синонимы, производные и специфические ферменты, связанные с названием "целлюлаза", включают эндо-1,4 β-D-глюканазу (β-1,4-глюканазу, β-1,4-эндоглюкангидролазу, эндоглюканазу D, 1,4 (1,3;1,4) β-D-глюкан 4-глюканогидролазу), карбоксиметилцеллюлазу (CMCase), авицелазу, целлюдекстриназу, целлюлазу А, целлюлозин АП, щелочную целлюлазу, целлюлазу А 3, 9,5 целлюлазу, целлюксиланазу и панцеллазу SS. Ферменты, которые расщепляют лигнин, иногда называли целлюлазами, но это устаревшее использование не рекомендуется; они являются ферментами, модифицирующими лигнин.

Структура

Большинство грибковых целлюлаз имеют двухдоменную структуру, состоящую из одного каталитического домена и одного домена, связывающего целлюлозу, соединенных гибким линкером. Эта структура адаптирована для работы с нерастворимым субстратом и позволяет ферменту диффундировать по поверхности в двух измерениях, подобно гусенице. Однако существуют также целлюлазы (в основном эндоглюканазы), которым не хватает доменов, связывающих целлюлозу. И связывание субстратов, и катализ зависят от трехмерной структуры фермента, которая возникает в результате степени сворачивания белка. Аминокислотная последовательность и расположение аминокислотных остатков в активном центре – месте связывания субстрата – могут влиять на такие факторы, как аффинность связывания лигандов, стабилизация субстратов в активном центре и каталитическая активность. Структура субстрата комплементарна точной структуре активного центра фермента. Изменения в положении остатков могут привести к искажению одного или нескольких из этих взаимодействий. Дополнительные факторы, такие как температура, pH и ионы металлов, влияют на нековалентные взаимодействия в структуре фермента. Виды *Thermotoga maritima* производят целлюлазы, состоящие из двух β-листов (белковых структур), окружающих центральную каталитическую область, которая является активным центром. Фермент классифицируется как эндоглюканаза, которая расщепляет β-1,4-гликозидные связи внутри цепях целлюлозы, облегчая дальнейшую деградацию полимера. Различные виды, принадлежащие к тому же семейству, что и *T. maritima*, производят целлюлазы с различной структурой. Эти ферменты гидролизуют субстрат карбоксиметилцеллюлозу. Связывание субстрата в активном центре индуцирует изменение конформации, что позволяет осуществить деградацию молекулы.

Комплексы клеточных клеток

У многих бактерий целлюлазы in vivo представляют собой сложные ферментные структуры, организованные в супрамолекулярные комплексы – целлюлозомы. Они могут содержать, но не ограничиваются этим, пять различных ферментативных субъединиц, а именно эндоцеллюлазы, экзоцеллюлазы, целлобиазы, окислительные целлюлазы и целлюлозные фосфорилазы, при этом в фактическом гидролизе β(1→4)-связи участвуют только экзоцеллюлазы и целлобиазы. Количество субъединиц, составляющих целлюлозомы, также может определять скорость ферментативной активности. Многодоменные целлюлазы широко распространены среди многих таксономических групп, однако целлюлазы анаэробных бактерий, содержащиеся в целлюлозомах, обладают наиболее сложной архитектурой, состоящей из различных типов модулей. Например, Clostridium cellulolyticum производит 13 модульных целлюлаз GH9, содержащих различное количество и расположение каталитических доменов (CD), углеводсвязывающих модулей (CBM), докеринов, линкеров и Ig-подобных доменов. Комплекс целлюлазы из Trichoderma reesei, например, состоит из компонента C1 (57 000 дальтон), который разделяет цепи кристаллической целлюлозы, эндоглюканазы (около 52 000 дальтон), экзоглюканазы (около 61 000 дальтон) и β-глюкозидазы (76 000 дальтон). В геномах бактерий, продуцирующих целлюлозомы, идентифицировано множество "сигнатурных" последовательностей, известных как докерины и когезины. В зависимости от аминокислотной последовательности и третичной структуры целлюлазы делятся на кланы и семейства. Многомодульные целлюлазы более эффективны, чем свободные ферменты (содержащие только CD), благодаря синергизму, обусловленному близким расположением фермента и целлюлозного субстрата. CBM участвуют в связывании целлюлозы, в то время как гликозилированные линкеры обеспечивают гибкость CD для повышения активности и защиты от протеаз, а также усиленного связывания с поверхностью целлюлозы. Подробности о β-глюкозидазной активности целлюлазы.

Применение

Целлюлаза используется в коммерческой переработке пищевых продуктов, в частности в производстве кофе. Она осуществляет гидролиз целлюлозы в процессе сушки кофейных зерен. Кроме того, целлюлазы широко применяются в текстильной промышленности и в составе стиральных порошков. Они также используются в целлюлозно-бумажной промышленности для различных целей и даже в фармацевтике. Целлюлаза применяется при ферментации биомассы для получения биотоплива, хотя этот процесс пока находится на относительно экспериментальной стадии. В медицине целлюлаза используется для лечения фитобезоаров – разновидности целлюлозного безоара, обнаруживаемого в желудке человека, и продемонстрировала эффективность в разрушении полимикробных бактериальных биопленок путем гидролиза β(1-4)-гликозидных связей в структурных матричных экзополисахаридах внеклеточного полимерного вещества (EPS).

Измерение

Поскольку нативный субстрат, целлюлоза, является полимером, нерастворимым в воде, традиционные методы определения редуцирующих сахаров с использованием этого субстрата не могут быть применены для измерения активности целлюлазы. Аналитики разработали ряд альтернативных методов. Метод DNSA Активность целлюлазы определялась путем инкубации 0,5 мл супернатанта с 0,5 мл 1% карбоксиметилцеллюлозы (CMC) в 0,05 М цитратном буфере (pH 4,8) при 50 °C в течение 30 минут. Реакцию останавливали добавлением 3 мл реагента динитросалициловой кислоты. Оптическая плотность измерялась при 540 нм. Вискометр можно использовать для измерения уменьшения вязкости раствора, содержащего водорастворимое производное целлюлозы, такое как карбоксиметилцеллюлоза, после инкубации с образцом целлюлазы. Уменьшение вязкости прямо пропорционально активности целлюлазы. Хотя такие методы очень чувствительны и специфичны для эндоцеллюлазы (экзодействующие целлюлазы вызывают незначительное или отсутствие изменения вязкости), они ограничены сложностью определения активности в стандартных энзимных единицах (микромолях гидролизованного субстрата или образовавшегося продукта в минуту).

Подложки целлоолигосахаридов

Нижние олигосахариды DP cello (DP2-6) достаточно растворимы в воде, чтобы служить подходящими субстратами для ферментов целлюлазы. Однако, поскольку эти субстраты сами по себе являются восстанавливающими сахарами, они не подходят для использования в традиционных анализах на восстанавливающие сахара из-за высокого фонового сигнала. Вместе с тем, гидролиз этих субстратов под действием целлюлазы можно отслеживать методами ВЭЖХ или ионной хроматографии, чтобы получить ценную информацию о требованиях к субстрату конкретного фермента целлюлазы.

Редуцированные субстраты цело-олигосахаридов

Олигосахариды целлюлозы могут быть химически восстановлены действием боргидрида натрия с образованием соответствующих полиолов (сахарных спиртов). Эти соединения не дают реакции в тестах на восстанавливающие сахара, однако продукты их гидролиза реагируют. Это делает олигосахариды целлюлозы, восстановленные боргидридом, ценными субстратами для определения активности целлюлазы с использованием традиционных методов определения восстанавливающих сахаров, таких как метод Нельсона-Симоги.

Реагенты с ферментами

Недавно были разработаны новые реагенты, позволяющие специфически измерять эндоцеллюлазу. Эти методы основаны на использовании функционализированных олигосахаридных субстратов в присутствии вспомогательного фермента. В приведенном примере фермент целлюлазы способен распознавать трисахаридный фрагмент целлюлозы и расщеплять его. Вспомогательный фермент, присутствующий в смеси реагентов (β-глюкозидаза), затем гидролизует фрагмент, содержащий хромофор или флюорофор. Анализ останавливается добавлением щелочного раствора, который прекращает ферментативную реакцию и депротонирует высвобожденное фенольное соединение, образуя фенолят. Активность целлюлазы в данном образце прямо пропорциональна количеству образовавшегося фенолята, которое можно измерить с помощью спектрофотометра. Ацетальная функционализация нередуцирующего конца трисахаридного субстрата предотвращает действие вспомогательной β-глюкозидазы на исходный субстрат.