Ген BRCA1 и предрасположенность к раку молочной железы.

Введение

Ген, известный своей ролью в раке молочной железы. Белок восприимчивости к раку молочной железы 1 типа — это белок, кодируемый геном BRCA1 (/b/r/æ/k/ə/'/w/ʌ/n/) у человека. Ортологи широко распространены у других видов позвоночных, тогда как геномы беспозвоночных могут кодировать более отдалённо родственный ген. BRCA1 является геном-супрессором опухолей человека (также известным как ген-опекун) и отвечает за репарацию ДНК. BRCA1 и BRCA2 — неродственные белки, но оба обычно экспрессируются в клетках молочной железы и других тканей, где они помогают восстанавливать поврежденную ДНК или уничтожают клетки, если ДНК не подлежит восстановлению. Они участвуют в восстановлении хромосомных повреждений, играя важную роль в безупречном восстановлении разрывов двойной спирали ДНК. Если BRCA1 или BRCA2 повреждены мутацией BRCA, поврежденная ДНК восстанавливается неправильно, что повышает риск развития рака молочной железы. BRCA1 и BRCA2 были описаны как «гены восприимчивости к раку молочной железы» и «белки восприимчивости к раку молочной железы». Преобладающий аллель обладает нормальной опухолеподавляющей функцией, в то время как мутации с высокой пенетрантностью в этих генах приводят к потере опухолеподавляющей функции, что коррелирует с повышенным риском развития рака молочной железы. BRCA1 объединяется с другими супрессорами опухолей, датчиками повреждений ДНК и сигнальными трансдукторами, образуя крупный мультисубъединичный белковый комплекс, известный как комплекс геномного надзора, связанный с BRCA1 (BASC). Методы определения вероятности развития рака у пациентов с мутациями в BRCA1 и BRCA2 были защищены патентами, принадлежащими или контролируемыми компанией Myriad Genetics, что вызвало споры из-за высоких цен и невозможности получения второго мнения в других диагностических лабораториях, что привело к знаковому судебному процессу «Ассоциация молекулярной патологии против Myriad Genetics».

Открытие

Первое свидетельство существования гена, кодирующего фермент репарации ДНК, вовлеченный в предрасположенность к раку молочной железы, было получено в лаборатории Мэри Клэр Кинг Калифорнийского университета в Беркли в 1990 году. Через четыре года, после международной гонки по поиску этого гена, он был клонирован в 1994 году учеными из Университета Юты, Национального института экологического здоровья (NIEHS) и компании Myriad Genetics.

Цинковый РИНГ-домен пальца

Мотив RING, Zn-палец, обнаруженный в эукариотических пептидах, имеет длину 40–60 аминокислот и состоит из восьми консервированных остатков, связывающих металлы – двух квартетов цистеина или гистидина, координирующих два атома цинка. Этот мотив содержит короткий антипараллельный β-лист, две петли, связывающие цинк, и центральную α-спираль в небольшом домене. Этот домен RING взаимодействует с ассоциированными белками, включая BARD1, который также содержит мотив RING, для формирования гетеродимера. Мотив RING белка BRCA1 фланкирован α-спиралями, образованными остатками 8–22 и 81–96 белка BRCA1. Он взаимодействует с гомологичной областью в BARD1, также состоящей из Zn-пальца RING, фланкированного двумя α-спиралями, сформированными из остатков 36–48 и 101–116. Эти четыре спирали объединяются, образуя интерфейс гетеродимеризации и стабилизируя гетеродимерный комплекс BRCA1/BARD1. Дополнительная стабилизация достигается за счет взаимодействий между соседними остатками во фланкирующей области и гидрофобных взаимодействий. Взаимодействие BARD1/BRCA1 нарушается опухолегенными аминокислотными заменами в BRCA1, что указывает на то, что формирование стабильного комплекса между этими белками может быть важным аспектом супрессии опухолей BRCA1. Он присоединяется к белкам и маркирует их для деградации. Убиквитинирование происходит посредством белка-слияния BRCA1 и блокируется хелатированием цинка. Домены BRCT, содержащие 85–95 аминокислот, могут встречаться как отдельные модули или как множественные тандемные повторы, содержащие два домена. Обе эти возможности могут присутствовать в одном белке в различных конформациях. В BRCA1 двойные тандемные повторы доменов BRCT расположены последовательно, «голова к хвосту», в трехмерной структуре, скрывая 1600 Å гидрофобной площади поверхности, доступной для растворителя, на интерфейсе. Все это способствует плотно упакованной структуре «штырь в отверстии», составляющей интерфейс. Эти гомологичные домены взаимодействуют для контроля клеточных реакций на повреждение ДНК. Миссенс-мутация на интерфейсе этих двух белков может нарушить клеточный цикл, что увеличивает риск развития рака.

The RING motif, a Zn finger found in eukaryotic peptides, is 40–60 amino acids long and consists of eight conserved metal binding residues, two quartets of cysteine or histidine residues that coordinate two zinc atoms. This motif contains a short anti parallel beta sheet, two zinc binding loops and a central alpha helix in a small domain. This RING domain interacts with associated proteins, including BARD1, which also contains a RING motif, to form a heterodimer. The BRCA1 RING motif is flanked by alpha helices formed by residues 8–22 and 81–96 of the BRCA1 protein. It interacts with a homologous region in BARD1 also consisting of a RING finger flanked by two alpha helices formed from residues 36–48 and 101–116. These four helices combine to form a heterodimerization interface and stabilize the BRCA1 BARD1 heterodimer complex. Additional stabilization is achieved by interactions between adjacent residues in the flanking region and hydrophobic interactions. The BARD1/BRCA1 interaction is disrupted by tumorigenic amino acid substitutions in BRCA1, implying that the formation of a stable complex between these proteins may be an essential aspect of BRCA1 tumor suppression. It attaches to proteins and labels them for destruction. Ubiquitination occurs via the BRCA1 fusion protein and is abolished by zinc chelation. The 85–95 amino acid domains in BRCT can be found as single modules or as multiple tandem repeats containing two domains. Both of these possibilities can occur in a single protein in a variety of different conformations. In BRCA1 the dual tandem repeat BRCT domains are arranged in a head to tail fashion in the three dimensional structure, burying 1600 Å of hydrophobic, solvent accessible surface area in the interface. These all contribute to the tightly packed knob in hole structure that comprises the interface. These homologous domains interact to control cellular responses to DNA damage. A missense mutation at the interface of these two proteins can perturb the cell cycle, resulting a greater risk of developing cancer.

Функция и механизм

BRCA1 входит в состав комплекса, восстанавливающего двунитевые разрывы в ДНК. Нити ДНК двойной спирали постоянно разрываются по мере повреждения. Иногда разрывается только одна нить, иногда обе нити разрываются одновременно. Агенты, вызывающие сшивки ДНК, являются важным источником повреждений хромосом/ДНК. Двунитевые разрывы возникают как промежуточные этапы после удаления сшивок, и, действительно, биаллельные мутации в BRCA1 были идентифицированы как причина анемии Фанкони, комплементарной группы S (FA S) – генетического заболевания, связанного с повышенной чувствительностью к агентам, вызывающим сшивки ДНК. BRCA1 является частью белкового комплекса, который восстанавливает ДНК, когда повреждены обе нити. В этом случае механизму восстановления сложно "знать", как заменить правильную последовательность ДНК, и существует несколько способов попытаться выполнить восстановление. Механизм восстановления двунитевых разрывов, в котором участвует BRCA1, – гомологично-направленное восстановление, при котором белки восстановления копируют идентичную последовательность с неповрежденной сестринской хроматиды. FA S почти всегда является летальным состоянием внутриутробно; в литературе описано лишь несколько случаев биаллельных мутаций BRCA1, несмотря на высокую частоту носительства среди ашкеназов, и ни одного случая после 2013 года. В ядре многих типов нормальных клеток белок BRCA1 взаимодействует с RAD51 во время восстановления двунитевых разрывов ДНК. Эти разрывы могут быть вызваны естественной радиацией или другими воздействиями, но также возникают при обмене генетическим материалом между хромосомами (гомологичная рекомбинация, например, "кроссинговер" во время мейоза). Белок BRCA2, выполняющий функцию, аналогичную BRCA1, также взаимодействует с белком RAD51. Оказывая влияние на восстановление повреждений ДНК, эти три белка играют роль в поддержании стабильности генома человека. BRCA1 также участвует в другом типе восстановления ДНК, называемом восстановлением неспаренных оснований. BRCA1 взаимодействует с белком MSH2, участвующим в восстановлении неспаренных оснований ДНК. Сообщается, что уровни MSH2, MSH6, PARP и некоторых других белков, участвующих в восстановлении одноцепочечных разрывов, повышены в опухолях молочной железы с дефицитом BRCA1. Белок, содержащий валозин (VCP, также известный как p97), играет роль в привлечении BRCA1 к поврежденным участкам ДНК. После ионизирующего излучения VCP привлекается к повреждениям ДНК и взаимодействует с убиквитин-лигазой RNF8 для организации сборки сигнальных комплексов, обеспечивающих эффективное восстановление двунитевых разрывов. BRCA1 взаимодействует с VCP. BRCA1 также взаимодействует с c-Myc и другими белками, критически важными для поддержания стабильности генома. BRCA1 напрямую связывается с ДНК, проявляя более высокое сродство к разветвленным структурам ДНК. Эта способность связываться с ДНК способствует его способности ингибировать нуклеазную активность комплекса MRN, а также нуклеазную активность Mre11 в одиночку. Это может объяснить роль BRCA1 в содействии восстановлению ДНК с более низкой точностью посредством негомологичного соединения концов (NHEJ). BRCA1 также колокализует с γH2AX (гистоном H2AX, фосфорилированным на серине 139) в очагах восстановления двунитевых разрывов ДНК, что указывает на его возможную роль в привлечении факторов восстановления. Формальдегид и ацетальдегид являются распространенными источниками сшивок ДНК в окружающей среде, которые часто требуют восстановления, опосредованного путями, содержащими BRCA1. Эта функция восстановления ДНК необходима; мыши с мутациями, приводящими к потере функции в обоих аллелях BRCA1, нежизнеспособны, и по состоянию на 2015 год было известно только о двух взрослых, имеющих мутации, приводящие к потере функции в обоих аллелях (что приводит к FA S); у обоих были врожденные или проблемы с развитием, и у обоих был рак. Предполагалось, что один из них дожил до взрослого возраста, потому что одна из мутаций BRCA1 была гипоморфной.

BRCA1 is part of a complex that repairs double strand breaks in DNA. The strands of the DNA double helix are continuously breaking as they become damaged. Sometimes only one strand is broken, sometimes both strands are broken simultaneously. DNA cross linking agents are an important source of chromosome/DNA damage. Double strand breaks occur as intermediates after the crosslinks are removed, and indeed, biallelic mutations in BRCA1 have been identified to be responsible for Fanconi Anemia, Complementation Group S (FA S), a genetic disease associated with hypersensitivity to DNA crosslinking agents. BRCA1 is part of a protein complex that repairs DNA when both strands are broken. When this happens, it is difficult for the repair mechanism to "know" how to replace the correct DNA sequence, and there are multiple ways to attempt the repair. The double strand repair mechanism in which BRCA1 participates is homology directed repair, where the repair proteins copy the identical sequence from the intact sister chromatid. FA S is almost always a lethal condition in utero; only a handful cases of biallelic BRCA1 mutations have been reported in literature despite the high carrier frequencies in the Ashkenazim, and none since 2013. In the nucleus of many types of normal cells, the BRCA1 protein interacts with RAD51 during repair of DNA double strand breaks. These breaks can be caused by natural radiation or other exposures, but also occur when chromosomes exchange genetic material (homologous recombination, e. g., "crossing over" during meiosis). The BRCA2 protein, which has a function similar to that of BRCA1, also interacts with the RAD51 protein. By influencing DNA damage repair, these three proteins play a role in maintaining the stability of the human genome. BRCA1 is also involved in another type of DNA repair, termed mismatch repair. BRCA1 interacts with the DNA mismatch repair protein MSH2. MSH2, MSH6, PARP and some other proteins involved in single strand repair are reported to be elevated in BRCA1 deficient mammary tumors. A protein called valosin containing protein (VCP, also known as p97) plays a role to recruit BRCA1 to the damaged DNA sites. After ionizing radiation, VCP is recruited to DNA lesions and cooperates with the ubiquitin ligase RNF8 to orchestrate assembly of signaling complexes for efficient DSB repair. BRCA1 interacts with VCP. BRCA1 also interacts with c Myc, and other proteins that are critical to maintain genome stability. BRCA1 directly binds to DNA, with higher affinity for branched DNA structures. This ability to bind to DNA contributes to its ability to inhibit the nuclease activity of the MRN complex as well as the nuclease activity of Mre11 alone. This may explain a role for BRCA1 to promote lower fidelity DNA repair by non homologous end joining (NHEJ). BRCA1 also colocalizes with γ H2AX (histone H2AX phosphorylated on serine 139) in DNA double strand break repair foci, indicating it may play a role in recruiting repair factors. Formaldehyde and acetaldehyde are common environmental sources of DNA cross links that often require repairs mediated by BRCA1 containing pathways. This DNA repair function is essential; mice with loss of function mutations in both BRCA1 alleles are not viable, and as of 2015 only two adults were known to have loss of function mutations in both alleles (leading to FA S); both had congenital or developmental issues, and both had cancer. One was presumed to have survived to adulthood because one of the BRCA1 mutations was hypomorphic.

Транскрипция

Было показано, что BRCA1 совместно очищается с голоферментом человеческой РНК-полимеразы II в экстрактах HeLa, что указывает на то, что он является компонентом голофермента. Однако более поздние исследования опровергли это предположение, показав, что преобладающий комплекс, включающий BRCA1 в клетках HeLa, представляет собой комплекс размером 2 мегадальтона, содержащий SWI/SNF. SWI/SNF – это комплекс ремоделирования хроматина. Искусственное закрепление BRCA1 на хроматине приводило к деконденсации гетерохроматина, хотя для этой роли не требовался домен, взаимодействующий с SWI/SNF. Определенные вариации гена BRCA1 приводят к повышенному риску развития рака молочной железы как части наследственного синдрома рака молочной железы и яичников. Исследователи выявили сотни мутаций в гене BRCA1, многие из которых связаны с повышенным риском развития рака. У женщин с аномальным геном BRCA1 или BRCA2 риск развития рака молочной железы к 90 годам достигает 80%; повышенный риск развития рака яичников составляет около 55% у женщин с мутациями BRCA1 и около 25% у женщин с мутациями BRCA2. Эти мутации могут быть изменениями в одной или небольшом количестве пар оснований ДНК (строительных блоков ДНК) и могут быть идентифицированы с помощью ПЦР и секвенирования ДНК. В некоторых случаях происходят перестройки больших сегментов ДНК. Эти большие сегменты, также называемые крупными перестройками, могут представлять собой делецию или дупликацию одного или нескольких экзонов в гене. Классические методы обнаружения мутаций (секвенирование) не способны выявлять такие типы мутаций. Были предложены другие методы: традиционная количественная ПЦР, амплификация зондов, зависящая от мультиплексной лигации (MLPA) и количественная мультиплексная ПЦР коротких флуоресцентных фрагментов (QMPSF). Недавно были предложены новые методы: гетеродуплексный анализ (HDA) с помощью многокапиллярного электрофореза или специализированный олигонуклеотидный массив на основе сравнительной геномной гибридизации (array CGH). Некоторые результаты указывают на то, что гиперметилирование промотора BRCA1, о котором сообщалось при некоторых видах рака, может рассматриваться как механизм инактивации экспрессии BRCA1. Мутировавший ген BRCA1 обычно производит белок, который функционирует неправильно. Исследователи полагают, что дефектный белок BRCA1 не способен помочь в восстановлении повреждений ДНК, что приводит к мутациям в других генах. Эти мутации могут накапливаться и позволять клеткам бесконтрольно расти и делиться, формируя опухоль. Таким образом, инактивирующие мутации BRCA1 приводят к предрасположенности к раку. К 3'-UTR мРНК BRCA1 может связываться микроРНК (миРНК), Mir 17. Предполагается, что вариации в этой миРНК, наряду с микроРНК Mir 30, могут повышать восприимчивость к раку молочной железы. Помимо рака молочной железы, мутации в гене BRCA1 также увеличивают риск развития рака яичников и простаты. Кроме того, предраковые поражения (дисплазия) в маточных трубах связаны с мутациями гена BRCA1. Патогенные мутации в любом месте модельного пути, содержащего BRCA1 и BRCA2, значительно увеличивают риск развития некоторых видов лейкемий и лимфом. Как упоминалось ранее, биаллельное и гомозиготное наследование гена BRCA1 приводит к синдрому FA S, который почти всегда является эмбрионально летальным состоянием.

BRCA1 was shown to co purify with the human RNA Polymerase II holoenzyme in HeLa extracts, implying it is a component of the holoenzyme. Later research, however, contradicted this assumption, instead showing that the predominant complex including BRCA1 in HeLa cells is a 2 megadalton complex containing SWI/SNF. SWI/SNF is a chromatin remodeling complex. Artificial tethering of BRCA1 to chromatin was shown to decondense heterochromatin, though the SWI/SNF interacting domain was not necessary for this role.]] Certain variations of the BRCA1 gene lead to an increased risk for breast cancer as part of a hereditary breast–ovarian cancer syndrome. Researchers have identified hundreds of mutations in the BRCA1 gene, many of which are associated with an increased risk of cancer. Females with an abnormal BRCA1 or BRCA2 gene have up to an 80% risk of developing breast cancer by age 90; increased risk of developing ovarian cancer is about 55% for females with BRCA1 mutations and about 25% for females with BRCA2 mutations. These mutations can be changes in one or a small number of DNA base pairs (the building blocks of DNA), and can be identified with PCR and DNA sequencing. In some cases, large segments of DNA are rearranged. Those large segments, also called large rearrangements, can be a deletion or a duplication of one or several exons in the gene. Classical methods for mutation detection (sequencing) are unable to reveal these types of mutation. Other methods have been proposed: traditional quantitative PCR, multiplex ligation dependent probe amplification (MLPA), and Quantitative Multiplex PCR of Short Fluorescent Fragments (QMPSF). Newer methods have also been recently proposed: heteroduplex analysis (HDA) by multi capillary electrophoresis or also dedicated oligonucleotides array based on comparative genomic hybridization (array CGH). Some results suggest that hypermethylation of the BRCA1 promoter, which has been reported in some cancers, could be considered as an inactivating mechanism for BRCA1 expression. A mutated BRCA1 gene usually makes a protein that does not function properly. Researchers believe that the defective BRCA1 protein is unable to help fix DNA damage leading to mutations in other genes. These mutations can accumulate and may allow cells to grow and divide uncontrollably to form a tumor. Thus, BRCA1 inactivating mutations lead to a predisposition for cancer. BRCA1 mRNA 3' UTR can be bound by an miRNA, Mir 17 microRNA. It has been suggested that variations in this miRNA along with Mir 30 microRNA could confer susceptibility to breast cancer. In addition to breast cancer, mutations in the BRCA1 gene also increase the risk of ovarian and prostate cancers. Moreover, precancerous lesions (dysplasia) within the fallopian tube have been linked to BRCA1 gene mutations. Pathogenic mutations anywhere in a model pathway containing BRCA1 and BRCA2 greatly increase risks for a subset of leukemias and lymphomas. As aforementioned, biallelic and homozygous inheritance of the BRCA1 gene leads to FA S, which is almost always an embryonically lethal condition.

Низкая экспрессия BRCA1 при раке молочной железы и яичников

Экспрессия BRCA1 снижена или не обнаруживается в большинстве высокодифференцированных протоковых раков молочной железы. Давно известно, что потеря активности BRCA1, будь то из-за мутаций зародышевой линии или подавления экспрессии гена, приводит к формированию опухолей в определенных тканях-мишенях. В частности, снижение экспрессии BRCA1 способствует прогрессированию как спорадических, так и наследственных опухолей молочной железы. Сниженная экспрессия BRCA1 является онкогенной, поскольку она играет важную роль в восстановлении повреждений ДНК, особенно двухцепочечных разрывов, посредством потенциально безошибочного пути гомологичной рекомбинации. Поскольку клетки, лишенные белка BRCA1, склонны восстанавливать повреждения ДНК альтернативными, более подверженными ошибкам механизмами, снижение или подавление этого белка генерирует мутации и грубые хромосомные перестройки, которые могут привести к прогрессированию рака молочной железы. При серозных карциномах яичников, подкатегории, составляющей около 2/3 эпителиальных опухолей яичников (EOC), низкая экспрессия BRCA1 наблюдается более чем в 50% случаев. Боутелл проанализировал данные литературы, указывающие на то, что дефицит гомологичной рекомбинационной репарации, вызванный дефицитом BRCA1, является онкогенным. В частности, этот дефицит запускает каскад молекулярных событий, которые определяют эволюцию высокодифференцированного серозного рака яичников и влияют на его ответ на терапию. Особо отмечалось, что дефицит BRCA1 может быть причиной онкогенеза, независимо от того, вызван ли он мутацией BRCA1 или каким-либо другим событием, приводящим к дефициту экспрессии BRCA1. Помимо своей роли в восстановлении повреждений ДНК, BRCA1 способствует апоптозу в клеточных линиях рака молочной железы и яичников, когда клетки подвергаются стрессу от агентов, включая ионизирующее излучение, вызывающих повреждения ДНК. Репарация повреждений ДНК и апоптоз – это два ферментативных процесса, необходимых для поддержания целостности генома человека. Клетки с дефицитом репарации ДНК склонны к накоплению повреждений ДНК, и если такие клетки также дефектны в апоптозе, они, как правило, выживают даже при избыточном повреждении ДНК. Репликация ДНК в таких клетках приводит к мутациям, которые могут вызвать рак. Таким образом, BRCA1, по-видимому, выполняет две функции, связанные с профилактикой рака: одна – способствовать восстановлению определенного класса повреждений, а другая – индуцировать апоптоз, если уровень таких повреждений ДНК превышает возможности клетки к восстановлению. Аналогично, мутации BRCA1 наблюдаются лишь примерно в 18% случаев рака яичников (13% мутаций зародышевой линии и 5% соматических мутаций). Таким образом, хотя экспрессия BRCA1 низка в большинстве этих случаев рака, мутация BRCA1 не является основной причиной снижения экспрессии. Определенные латентные вирусы, часто обнаруживаемые в опухолях рака молочной железы, могут снижать экспрессию гена BRCA1 и вызывать развитие опухолей молочной железы.

BRCA1 expression is reduced or undetectable in the majority of high grade, ductal breast cancers. It has long been noted that loss of BRCA1 activity, either by germ line mutations or by down regulation of gene expression, leads to tumor formation in specific target tissues. In particular, decreased BRCA1 expression contributes to both sporadic and inherited breast tumor progression. Reduced expression of BRCA1 is tumorigenic because it plays an important role in the repair of DNA damages, especially double strand breaks, by the potentially error free pathway of homologous recombination. Since cells that lack the BRCA1 protein tend to repair DNA damages by alternative more error prone mechanisms, the reduction or silencing of this protein generates mutations and gross chromosomal rearrangements that can lead to progression to breast cancer. In serous ovarian carcinomas, a sub category constituting about 2/3 of EOCs, low BRCA1 expression occurs in more than 50% of cases. Bowtell reviewed the literature indicating that deficient homologous recombination repair caused by BRCA1 deficiency is tumorigenic. In particular this deficiency initiates a cascade of molecular events that sculpt the evolution of high grade serous ovarian cancer and dictate its response to therapy. Especially noted was that BRCA1 deficiency could be the cause of tumorigenesis whether due to BRCA1 mutation or any other event that causes a deficiency of BRCA1 expression. In addition to its role in repairing DNA damages, BRCA1 facilitates apoptosis in breast and ovarian cell lines when cells are stressed by agents, including ionizing radiation, that cause DNA damages. Repair of DNA damages and apoptosis are two enzymatic processes essential for maintaining genome integrity in humans. Cells that are deficient in DNA repair tend to accumulate DNA damages, and when such cells are also defective in apoptosis they tend to survive even with excess DNA damage. Replication of DNA in such cells leads to mutations and these mutations may cause cancer. Thus BRCA1 appears to have two roles related to the prevention of cancer, where one role is to promote repair of a specific class of damages and the second role is to induce apoptosis if the level of such DNA damage is beyond the cell’s repair capability Similarly, BRCA1 mutations are only seen in about 18% of ovarian cancers (13% germline mutations and 5% somatic mutations). Thus, while BRCA1 expression is low in the majority of these cancers, BRCA1 mutation is not a major cause of reduced expression. Certain latent viruses, which are frequently detected in breast cancer tumors, can decrease the expression of the BRCA1 gene and cause the development of breast tumors.

Гиперметилирование промотора BRCA1 при раке молочной железы и яичников

Гиперметилирование промотора BRCA1 было обнаружено только в 13% неселекционированных первичных карцином молочной железы. Аналогично, гиперметилирование промотора BRCA1 наблюдалось только в 5–15% случаев рака яичников (EOC). Рак молочной железы можно классифицировать на основе статуса рецепторов или гистологии, включая тройной негативный рак молочной железы (15–25% случаев рака молочной железы), HER2-положительный (15–30% случаев рака молочной железы), ER+/PR+ (около 70% случаев рака молочной железы) и инвазивную лобулярную карциному (около 5–10% инвазивного рака молочной железы). У всех четырех типов рака молочной железы было обнаружено примерно 100-кратное увеличение уровня miR-182 по сравнению с нормальной тканью молочной железы. В клеточных линиях рака молочной железы наблюдается обратная корреляция между уровнем белка BRCA1 и экспрессией miR-182. Таким образом, miR-146a и/или miR-146b 5p также могут способствовать снижению экспрессии BRCA1 при этих тройных негативных формах рака молочной железы.

Репрессия микроРНК BRCA1 при раке яичников

Как при серозной трубной внутриэпителиальной карциноме (прекурсоре высокодифференцированного серозного карцинома яичников (HG SOC), так и при самой HG SOC, miR-182 переэкспрессируется примерно в 70% случаев. В клетках с переэкспрессией miR-182 уровень BRCA1 оставался низким даже после воздействия ионизирующего излучения (которое обычно повышает экспрессию BRCA1). Дефекты в репарации ДНК, по-видимому, лежат в основе многих форм рака. При недостаточной репарации ДНК повреждения ДНК склонны к накоплению. Избыточное повреждение ДНК может увеличивать число мутационных ошибок во время репликации ДНК из-за ошибок в транслезионном синтезе. Избыточное повреждение ДНК также может приводить к увеличению эпигенетических изменений из-за ошибок в процессе репарации ДНК. Такие мутации и эпигенетические изменения могут способствовать развитию рака. Частый микроРНК-индуцированный дефицит BRCA1 при раке молочной железы и яичников, вероятно, способствует прогрессированию этих видов рака.

Женская фертильность

С возрастом репродуктивная функция женщин снижается, что приводит к менопаузе. Это снижение связано с уменьшением числа овариальных фолликулов. Хотя при рождении в яичнике человека присутствует около 1 миллиона ооцитов, овулируют лишь около 500 (около 0,05%) из них. Снижение овариального резерва, по-видимому, происходит с постоянно возрастающей скоростью с возрастом и приводит к почти полному истощению резерва примерно к 52 годам. По мере снижения овариального резерва и фертильности с возрастом параллельно увеличивается частота неудач беременности и мейотических ошибок, приводящих к хромосомным аномалиям. Женщины с мутацией BRCA1 в зародышевой линии, по-видимому, имеют сниженный резерв ооцитов и уменьшенную фертильность по сравнению с женщинами, стареющими естественным образом. Кроме того, у женщин с унаследованной мутацией BRCA1 менопауза наступает преждевременно. Поскольку BRCA1 является ключевым белком, участвующим в репарации ДНК, эти данные свидетельствуют о том, что естественным образом возникающие повреждения ДНК в ооцитах восстанавливаются менее эффективно у женщин с дефектом BRCA1, и эта неэффективность репарации приводит к раннему нарушению репродуктивной функции. Примордиальные фолликулы содержат ооциты, находящиеся на промежуточной (профаза I) стадии мейоза. Мейоз – это общий процесс в эукариотических организмах, посредством которого формируются зародышевые клетки, и, вероятно, представляет собой адаптацию для удаления повреждений ДНК, особенно разрывов двойных нитей, из геномной ДНК зародышевой линии. (См. также статью «Мейоз»). Гомологичная рекомбинационная репарация, в которой участвует BRCA1, особенно активно протекает во время мейоза. Было обнаружено, что экспрессия четырех ключевых генов, необходимых для гомологичной рекомбинационной репарации разрывов двойных нитей ДНК (BRCA1, MRE11, RAD51 и ATM), снижается с возрастом в ооцитах человека и мыши. Эта корреляция позволяет предположить, что низкий уровень BRCA1 при раке и, как следствие, сниженный уровень репарации ДНК обуславливают уязвимость раковых клеток к лечению агентами, вызывающими сшивки ДНК. Высокий уровень BRCA1 может защищать раковые клетки, действуя в пути, который устраняет повреждения ДНК, вызванные препаратами платины. Таким образом, уровень экспрессии BRCA1 является потенциально важным инструментом для индивидуализации химиотерапии при лечении рака легких.

As women age, reproductive performance declines, leading to menopause. This decline is tied to a reduction in the number of ovarian follicles. Although about 1 million oocytes are present at birth in the human ovary, only about 500 (about 0.05%) of these ovulate. The decline in ovarian reserve appears to occur at a constantly increasing rate with age, and leads to nearly complete exhaustion of the reserve by about age 52. As ovarian reserve and fertility decline with age, there is also a parallel increase in pregnancy failure and meiotic errors, resulting in chromosomally abnormal conceptions. Women with a germ line BRCA1 mutation appear to have a diminished oocyte reserve and decreased fertility compared to normally aging women. Furthermore, women with an inherited BRCA1 mutation undergo menopause prematurely. Since BRCA1 is a key DNA repair protein, these findings suggest that naturally occurring DNA damages in oocytes are repaired less efficiently in women with a BRCA1 defect, and that this repair inefficiency leads to early reproductive failure. Primordial follicles contain oocytes that are at an intermediate (prophase I) stage of meiosis. Meiosis is the general process in eukaryotic organisms by which germ cells are formed, and it is likely an adaptation for removing DNA damages, especially double strand breaks, from germ line DNA. (Also see article Meiosis). Homologous recombinational repair employing BRCA1 is especially promoted during meiosis. It was found that expression of four key genes necessary for homologous recombinational repair of DNA double strand breaks (BRCA1, MRE11, RAD51 and ATM) decline with age in the oocytes of humans and mice, This correlation implies that low BRCA1 in cancer, and the consequent low level of DNA repair, causes vulnerability of cancer to treatment by the DNA cross linking agents. High BRCA1 may protect cancer cells by acting in a pathway that removes the damages in DNA introduced by the platinum drugs. Thus the level of BRCA1 expression is a potentially important tool for tailoring chemotherapy in lung cancer management.

Патенты, правоприменение, судебные споры и споры

Патентная заявка на изолированный ген BRCA1 и способствующие развитию рака мутации, описанные выше, а также методы диагностики вероятности развития рака молочной железы, были поданы Университетом Юты, Национальным институтом наук об окружающей среде (NIEHS) и Myriad Genetics в 1994 году. В течение следующего года Myriad (в сотрудничестве с исследователями из Endo Recherche, Inc., HSC Research & Development Limited Partnership и Университета Пенсильвании) изолировала и секвенировала ген BRCA2, выявила ключевые мутации, и первый патент на BRCA2 был подан в США компанией Myriad и другими учреждениями в 1995 году. Myriad является эксклюзивным лицензиатом этих патентов и обеспечивает их соблюдение в США в отношении клинических диагностических лабораторий. Срок действия патентов начал истекать в 2014 году. Согласно статье, опубликованной в журнале Genetic Medicine в 2010 году, "патентная ситуация за пределами Соединенных Штатов более сложная. Например, патенты были получены, но их игнорируют провинциальные системы здравоохранения в Канаде. В Австралии и Великобритании лицензиат Myriad разрешил использование патентов системами здравоохранения, но в августе 2008 года объявил об изменении планов. В единственном общеевропейском патенте Myriad запатентована только одна мутация, хотя некоторые патенты все еще находятся на рассмотрении в рамках процедуры возражения. По сути, Соединенные Штаты – единственная юрисдикция, где сильная патентная позиция Myriad обеспечила статус единственного поставщика". Питер Мелдрум, генеральный директор Myriad Genetics, признал, что у Myriad есть "другие конкурентные преимущества, которые могут сделать такое [патентное] преследование ненужным" в Европе. Как и в случае с любым геном, выявление вариаций в BRCA1 не представляет сложности. Истинная ценность заключается в понимании клинических последствий конкретного варианта. Myriad располагает обширной, проприетарной базой данных таких корреляций генотипа и фенотипа. В ответ разрабатываются параллельные базы данных с открытым исходным кодом. Юридические решения, касающиеся патентов на BRCA1 и BRCA2, повлияют на сферу генетического тестирования в целом. В июне 2013 года в деле "Ассоциация молекулярной патологии против Myriad Genetics" (No. 12-398) было процитировано единогласное решение Верховного суда США, согласно которому "естественно встречающийся сегмент ДНК является продуктом природы и не подлежит патентованию только потому, что он был изолирован", что аннулировало патенты Myriad на гены BRCA1 и BRCA2. Однако Суд также постановил, что манипулирование геном для создания чего-то, чего не существует в природе, все еще может быть патентоспособным. Федеральный суд Австралии пришел к противоположному выводу, подтвердив действительность австралийского патента Myriad Genetics на ген BRCA1 в феврале 2013 года. Федеральный суд также отклонил апелляцию в сентябре 2014 года. Ивонн Д'Арси выиграла дело против американской биотехнологической компании Myriad Genetics в Высшем суде Австралии. В своем единогласном решении от 7 октября 2015 года "Высокий суд установил, что изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая белок BRCA1, с определенными отклонениями от нормы, указывающими на предрасположенность к раку молочной железы и раку яичников, не является "патентоспособным изобретением"".

A patent application for the isolated BRCA1 gene and cancer promoting mutations discussed above, as well as methods to diagnose the likelihood of getting breast cancer, was filed by the University of Utah, National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) and Myriad Genetics in 1994; over the next year, Myriad, (in collaboration with investigators at Endo Recherche, Inc., HSC Research & Development Limited Partnership, and University of Pennsylvania), isolated and sequenced the BRCA2 gene and identified key mutations, and the first BRCA2 patent was filed in the U. S. by Myriad and other institutions in 1995. Myriad is the exclusive licensee of these patents and has enforced them in the US against clinical diagnostic labs. The patents began to expire in 2014. According to an article published in the journal, Genetic Medicine, in 2010, "The patent story outside the United States is more complicated For example, patents have been obtained but the patents are being ignored by provincial health systems in Canada. In Australia and the UK, Myriad's licensee permitted use by health systems but announced a change of plans in August 2008. Only a single mutation has been patented in Myriad's lone European wide patent, although some patents remain under review of an opposition proceeding. In effect, the United States is the only jurisdiction where Myriad's strong patent position has conferred sole provider status." Peter Meldrum, CEO of Myriad Genetics, has acknowledged that Myriad has "other competitive advantages that may make such [patent] enforcement unnecessary" in Europe. As with any gene, finding variation in BRCA1 is not hard. The real value comes from understanding what the clinical consequences of any particular variant are. Myriad has a large, proprietary database of such genotype phenotype correlations. In response, parallel open source databases are being developed. Legal decisions surrounding the BRCA1 and BRCA2 patents will affect the field of genetic testing in general. A June 2013 article, in Association for Molecular Pathology v. Myriad Genetics (No. 12 398), quoted the US Supreme Court's unanimous ruling that, "A naturally occurring DNA segment is a product of nature and not patent eligible merely because it has been isolated," invalidating Myriad's patents on the BRCA1 and BRCA2 genes. However, the Court also held that manipulation of a gene to create something not found in nature could still be eligible for patent protection. The Federal Court of Australia came to the opposite conclusion, upholding the validity of an Australian Myriad Genetics patent over the BRCA1 gene in February 2013. The Federal Court also rejected an appeal in September 2014. Yvonne D'Arcy won her case against US based biotech company Myriad Genetics in the High Court of Australia. In their unanimous decision on October 7, 2015, the "high court found that an isolated nucleic acid, coding for a BRCA1 protein, with specific variations from the norm that are indicative of susceptibility to breast cancer and ovarian cancer was not a 'patentable invention.'"