Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
РНК түрі
Type of RNA
Қысқа шаштық РНК немесе кіші шаштық РНК (shRNA/Шаштық вектор) – тар шаштық бұрылысы бар жасанды РНК молекуласы, РНК-ның араласуы (RNAi) арқылы нысаналық геннің экспрессиясын басу үшін қолданылады. Жасушалардағы shRNA экспрессиясы әдетте плазмидалар немесе вирустық немесе бактериялық векторлар арқылы жеткізіледі. shRNA салыстырмалы түрде төмен ыдырау және алмасу деңгейіне ие болғандықтан, RNAi-дың тиімді медиаторы болып табылады. Дегенмен, ол дәрілік қолдануда жанама әсерлер тудыруы мүмкін экспрессиялық векторды пайдалануды қажет етеді. Robusta shRNA экспрессиясын қамтамасыз ету үшін промоторды таңдау маңызды. Алғашқыда U6 және H1 сияқты полимераза III промоторлары қолданылды; алайда, бұл промоторлардың кеңістіктік және уақытша бақылауы жетіспейді. Бұл тәсіл 2012 жылы туыстық аденоматозды полипозбен ауыратын науқастарды емдеу үшін клиникалық сынақтарда қолданылды. Жасушаларда shRNA экспрессиясын алу үшін әр түрлі вирустық векторларды қолдануға болады, оның ішінде адено-ассоциирленген вирустар (AAV), аденовирустар және лентивирустар бар. Адено-ассоциирленген вирустар мен аденовирустарда геномдар эпизомалық күйде қалады. Бұл инсерциялық мутагенезден сақтауға мүмкіндік береді. Бірақ, жасушаның ұрпақтары жасушаның өте баяу бөлінуі жағдайында ғана вирусты жасуша бөлінуі арқылы жылдам жоғалтады. AAV аденовирустардан вирустық гендері алынып тасталғандығымен және олардың жинақтау сыйымдылығы төмендегендігімен ерекшеленеді. Лентивирустар транскрипциялық белсенді хроматин бөліктеріне еніп, осылайша ұрпақ жасушаларына беріледі. Бұл тәсілмен инсерциялық мутагенез қаупі артады; алайда, интеграза жетіспейтін лентивирусты қолдану арқылы қауіпті азайтуға болады.
A short hairpin RNA or small hairpin RNA (shRNA/Hairpin Vector) is an artificial RNA molecule with a tight hairpin turn that can be used to silence target gene expression via RNA interference (RNAi). Expression of shRNA in cells is typically accomplished by delivery of plasmids or through viral or bacterial vectors. shRNA is an advantageous mediator of RNAi in that it has a relatively low rate of degradation and turnover. However, it requires use of an expression vector, which has the potential to cause side effects in medicinal applications. The promoter choice is essential to achieve robust shRNA expression. At first, polymerase III promoters such as U6 and H1 were used; however, these promoters lack spatial and temporal control. This approach was used in 2012 in clinical trials to try to treat patients with Familial Adenomatous Polyposis. A variety of viral vectors can be used to obtain shRNA expression in cells including adeno associated viruses (AAVs), adenoviruses, and lentiviruses. With adeno associated viruses and adenoviruses, the genomes remain episomal. This is advantageous as insertional mutagenesis is avoided. It is disadvantageous in that the progeny of the cell will lose the virus quickly through cell division unless the cell divides very slowly. AAVs differ from adenoviruses in that the viral genes have been removed and they have diminished packing capacity. Lentiviruses integrate into sections of transcriptionally active chromatin and are thus passed on to progeny cells. With this approach there is increased risk of insertional mutagenesis; however, the risk can be reduced by using an integrase deficient lentivirus.
Әрекет ету механизмі
Вектор жаңашыр геномға енгеннен кейін, shRNA промотор таңдалысына байланысты полимераза II немесе полимераза III арқылы ядрода транскрипцияланады. Бұл өнім pri микроРНК-ны (pri miRNA) имитациялайды және Drosha арқылы өңделеді. Соның нәтижесінде алынған pre-shRNA, Exportin 5 арқылы ядродан шығарылады. Бұл өнім Dicer арқылы өңделіп, РНК-мен шақырылған үнсіздендіру кешеніне (RISC) жүктеледі. Сенімді (жолаушы) тізбегі ыдырайды. Антисенс (бағытшы) тізбегі RISC-ті комплементарлық тізбегі бар мРНК-ға бағыттайды. Толық сәйкестік болған жағдайда, RISC мРНК-ны кеседі. Толық емес сәйкестік болған жағдайда, RISC мРНК-ның трансляциясын тоқтатады. Екі жағдайда да shRNA нысана генінің үндеуін өшіреді.
Once the vector has integrated into the host genome, the shRNA is then transcribed in the nucleus by polymerase II or polymerase III depending on the promoter choice. The product mimics pri microRNA (pri miRNA) and is processed by Drosha. The resulting pre shRNA is exported from the nucleus by Exportin 5. This product is then processed by Dicer and loaded into the RNA induced silencing complex (RISC). The sense (passenger) strand is degraded. The antisense (guide) strand directs RISC to mRNA that has a complementary sequence. In the case of perfect complementarity, RISC cleaves the mRNA. In the case of imperfect complementarity, RISC represses translation of the mRNA. In both of these cases, the shRNA leads to target gene silencing.
Гендік терапияда қолдану
ШРНК-ның гендік белсенділікті тежеуге қабілетті, нақты және ұзаққа созылатын әсеріне байланысты, гендік терапияда қолдану үшін ШРНК-ны пайдалануға зор қызығушылық бар. Төменде ШРНК-ға негізделген терапияның үш мысалы қарастырылады. Gradalis, Inc. компаниясы FANG вакцинасын әзірледі, ол ілгерілеген қатерлі ісіктерді емдеуде қолданылады. FANG иммундық жүйені басаздайтын трансформациялық өсу факторларына (TGF) β1 және β2 қарсы екі функциялы ШРНК (bi shRNA) негізделген. Науқастардан алынған ісік жасушаларына электропорация әдісі арқылы екі функциялы ШРНК пен гранулоциттер мен макрофагтардың колониясын стимуляциялайтын факторды (GMCSF) кодтайтын плазмид енгізілді. Бұл жасушалар кейін сәулелендіріліп, науқасқа қайтадан инъекцияланды. Marina Biotech CEQ508 препаратын әзірледі, ол тұқым қуалаушы ішек полипозын емдеу үшін қолданылады. CEQ508 β-катенинге қарсы ШРНК жеткізу үшін бактериялық векторды пайдаланады. Gradalis, Inc. компаниясы дамыған екі функциялы ШРНК STMN1 (pbi shRNA STMN1) препаратын әзірледі, ол ілгерілеген және/немесе метастаздық қатерлі ісіктерді емдеуде қолданылады. Бұл pbi shRNA STMN1 статмин 1-ге қарсы әрекет етеді және биламеллярлық инвагинацияланған көпіршік (BIV) липоплекс (LP) технологиясы арқылы ісікке тікелей енгізіледі. ШРНК-ға негізделген терапиялық препараттарды әзірлеуде бірнеше қиындықтар туындайды. Ең маңызды мәселе – жеткізу. ШРНК әдетте вектор арқылы жеткізіледі, және олар тиімді болғанымен, қауіпсіздік тұрғысынан маңызды мәселелерді тудырады. Атап айтқанда, вирустық гендік терапия тәсілдері клиникалық сынақтарда қауіпті екенін көрсетті. Ретровирустық гендік терапияның бірінші буынында Вискотт-Олдрич синдромымен ауырған және вирустық векторлармен емделген науқастардың кейбіреуінде жедел Т-лимфолейкемия дамыды. Бұл вирустық вектордың ену орнына байланысты туындаған. RISC-тің артық жүктелуі де проблема болып табылады. Егер ШРНК деңгейі тым жоғары болса, жасуша эндогенді РНК-ны дұрыс өңдей алмайды, бұл маңызды проблемаларға әкелуі мүмкін. Тағы бір қиындық – науқастың емге қарсы иммундық жауабын дамыту мүмкін. Соңында, мақсаттан тыс әсерлер болуы мүмкін және ШРНК басқа күтпеген гендерді де белсенділіктен айыруы мүмкін. Сәтті ШРНК-ға негізделген жаңа терапиялық препараттарды әзірлеу үшін осы қиындықтардың барлығын ескеру қажет.
Due to the ability of shRNA to provide specific, long lasting, gene silencing there has been great interest in using shRNA for gene therapy applications. Three examples of shRNA based therapies are discussed below. Gradalis, Inc. developed the FANG vaccine, which is used in treatment of advanced cancers. FANG relies on a bifunctional shRNA (bi shRNA) against the immunosuppressive transforming growth factors (TGF) β1 and β2. Autologous tumor cells were harvested from patients and a plasmid encoding the bifunctional shRNA and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GMCSF) was introduced ex vivo through electroporation. These cells were later irradiated and injected back into the patient. Marina Biotech developed CEQ508 which is used to treat Familial Adenomatous Polyposis. CEQ508 uses a bacterial vector to deliver shRNA against β catenin. Gradalis, Inc. developed bifunctional shRNA STMN1 (pbi shRNA STMN1), which is used to treat advanced and/or metastatic cancers. This pbi shRNA STMN1 is against stathmin 1 and is delivered intratumorally through bilamellar invaginated vesicle (BIV) lipoplex (LP) technology. Several challenges typically confront shRNA based therapeutics. The most significant challenge is delivery. shRNA is typically delivered through use of a vector, and although they are generally efficient, they pose significant safety concerns. In particular, viral based gene therapy approaches have proved dangerous in past clinical trials. In the first generation of retro viral gene therapy, some patients treated with viral vectors for Wiskott–Aldrich syndrome developed acute T cell leukaemia. This was determined to have been caused by viral vector insertion location. Potential oversaturation of RISC is also a problem. If the shRNA is expressed at levels that are too high, the cell might not be able to correctly process the endogenous RNA which could cause significant problems. Another challenge is the possibility that the patient might mount an immune response against the therapy. Finally, there might be off target effects and the shRNA could silence other unintended genes. In developing successful new shRNA based therapeutics, all of these challenges must be taken into account.