Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Тип РНК
Type of RNA
Короткий РНК-волоконник или малый РНК-волоконник (shRNA/Вектор-волоконник) – это искусственная молекула РНК с плотной шпилькообразной структурой, которую можно использовать для подавления экспрессии целевого гена посредством интерференции РНК (РНКi). Экспрессия shRNA в клетках обычно достигается путем доставки плазмид или с использованием вирусных или бактериальных векторов. shRNA является эффективным медиатором РНКi, поскольку имеет относительно низкую скорость деградации и обновления. Однако для этого требуется использование экспрессионного вектора, который потенциально может вызывать побочные эффекты в медицинских применениях. Выбор промотора имеет решающее значение для обеспечения эффективной экспрессии shRNA. Изначально использовались промоторы полимеразы III, такие как U6 и H1; однако эти промоторы не обеспечивают пространственный и временной контроль. Этот подход был использован в 2012 году в клинических испытаниях для лечения пациентов с семейным аденоматозным полипозом. Для получения экспрессии shRNA в клетках можно использовать различные вирусные векторы, включая аденоассоциированные вирусы (AAV), аденовирусы и лентивирусы. При использовании аденоассоциированных вирусов и аденовирусов геномы остаются внехромосомными (эпизомальными). Это выгодно, поскольку предотвращается инсерционный мутагенез. Это невыгодно, поскольку потомство клетки быстро теряет вирус в процессе деления, если клетка не делится очень медленно. AAV отличаются от аденовирусов тем, что вирусные гены удалены и их упаковочная емкость снижена. Лентивирусы интегрируются в участки транскрипционно активного хроматина и, таким образом, передаются дочерним клеткам. При таком подходе повышается риск инсерционного мутагенеза; однако этот риск можно снизить, используя лентивирус с дефицитом интегразы.
A short hairpin RNA or small hairpin RNA (shRNA/Hairpin Vector) is an artificial RNA molecule with a tight hairpin turn that can be used to silence target gene expression via RNA interference (RNAi). Expression of shRNA in cells is typically accomplished by delivery of plasmids or through viral or bacterial vectors. shRNA is an advantageous mediator of RNAi in that it has a relatively low rate of degradation and turnover. However, it requires use of an expression vector, which has the potential to cause side effects in medicinal applications. The promoter choice is essential to achieve robust shRNA expression. At first, polymerase III promoters such as U6 and H1 were used; however, these promoters lack spatial and temporal control. This approach was used in 2012 in clinical trials to try to treat patients with Familial Adenomatous Polyposis. A variety of viral vectors can be used to obtain shRNA expression in cells including adeno associated viruses (AAVs), adenoviruses, and lentiviruses. With adeno associated viruses and adenoviruses, the genomes remain episomal. This is advantageous as insertional mutagenesis is avoided. It is disadvantageous in that the progeny of the cell will lose the virus quickly through cell division unless the cell divides very slowly. AAVs differ from adenoviruses in that the viral genes have been removed and they have diminished packing capacity. Lentiviruses integrate into sections of transcriptionally active chromatin and are thus passed on to progeny cells. With this approach there is increased risk of insertional mutagenesis; however, the risk can be reduced by using an integrase deficient lentivirus.
Механизм действия
После интеграции вектора в геном клетки-хозяина, shRNA затем транскрибируется в ядре полимеразой II или полимеразой III, в зависимости от выбранного промотора. Продукт имитирует первичную микроРНК (pri miRNA) и подвергается процессингу Drosha. Полученная пре-shRNA экспортируется из ядра Exportin 5. Этот продукт затем обрабатывается Dicer и загружается в РНК-индуцированный комплекс глушения генов (RISC). Смысловая (пассажирская) цепь деградирует. Антисмысловая (направляющая) цепь направляет RISC к мРНК, содержащей комплементарную последовательность. В случае полного комплементарности RISC расщепляет мРНК. В случае неполного комплементарности RISC подавляет трансляцию мРНК. В обоих случаях shRNA приводит к глушению целевого гена.
Once the vector has integrated into the host genome, the shRNA is then transcribed in the nucleus by polymerase II or polymerase III depending on the promoter choice. The product mimics pri microRNA (pri miRNA) and is processed by Drosha. The resulting pre shRNA is exported from the nucleus by Exportin 5. This product is then processed by Dicer and loaded into the RNA induced silencing complex (RISC). The sense (passenger) strand is degraded. The antisense (guide) strand directs RISC to mRNA that has a complementary sequence. In the case of perfect complementarity, RISC cleaves the mRNA. In the case of imperfect complementarity, RISC represses translation of the mRNA. In both of these cases, the shRNA leads to target gene silencing.
Применение в генной терапии
Из-за способности шРНК обеспечивать специфическое, длительное подавление генов, существует большой интерес к использованию шРНК в генной терапии. Ниже описаны три примера терапии на основе шРНК. Gradalis, Inc. разработала вакцину FANG, которая используется для лечения распространенных форм рака. FANG основана на бифункциональной шРНК (bi shRNA), направленной против иммуносупрессивных трансформирующих факторов роста (TGF) β1 и β2. У пациентов забирали аутологичные опухолевые клетки, а затем вводили ex vivo посредством электропорации плазмиду, кодирующую бифункциональную шРНК и стимулирующий фактор колоний гранулоцитов и макрофагов (GMCSF). Затем эти клетки облучали и вводили обратно пациенту. Marina Biotech разработала CEQ508 для лечения семейного аденоматозного полипоза. CEQ508 использует бактериальный вектор для доставки шРНК против β-катенина. Gradalis, Inc. разработала бифункциональную шРНК STMN1 (pbi shRNA STMN1) для лечения распространенных и/или метастатических форм рака. Эта pbi shRNA STMN1 направлена против статмина 1 и доставляется внутриопухолево с использованием технологии биламеллярных инвагинационных везикул (BIV) и липоплексов (LP). Существует ряд проблем, обычно возникающих при разработке терапевтических средств на основе шРНК. Наиболее значимая проблема – доставка. Обычно шРНК доставляется с помощью вектора, который, хотя и эффективен, вызывает серьезные опасения по поводу безопасности. В частности, подходы генной терапии на основе вирусов оказались опасными в прошлых клинических испытаниях. В первом поколении ретровирусной генной терапии у некоторых пациентов, получавших лечение вирусными векторами при синдроме Вискотта-Алдриха, развилась острая Т-клеточная лейкемия. Это было связано с местом интеграции вирусного вектора. Потенциальная перегрузка комплекса RISC также является проблемой. Если шРНК экспрессируется на слишком высоком уровне, клетка может не справиться с правильной обработкой эндогенной РНК, что может привести к серьезным последствиям. Другая проблема – возможность развития у пациента иммунного ответа на терапию. Наконец, возможны нецелевые эффекты, когда шРНК подавляет экспрессию других, непреднамеренных генов. При разработке новых эффективных терапевтических средств на основе шРНК необходимо учитывать все эти проблемы.
Due to the ability of shRNA to provide specific, long lasting, gene silencing there has been great interest in using shRNA for gene therapy applications. Three examples of shRNA based therapies are discussed below. Gradalis, Inc. developed the FANG vaccine, which is used in treatment of advanced cancers. FANG relies on a bifunctional shRNA (bi shRNA) against the immunosuppressive transforming growth factors (TGF) β1 and β2. Autologous tumor cells were harvested from patients and a plasmid encoding the bifunctional shRNA and granulocyte macrophage colony stimulating factor (GMCSF) was introduced ex vivo through electroporation. These cells were later irradiated and injected back into the patient. Marina Biotech developed CEQ508 which is used to treat Familial Adenomatous Polyposis. CEQ508 uses a bacterial vector to deliver shRNA against β catenin. Gradalis, Inc. developed bifunctional shRNA STMN1 (pbi shRNA STMN1), which is used to treat advanced and/or metastatic cancers. This pbi shRNA STMN1 is against stathmin 1 and is delivered intratumorally through bilamellar invaginated vesicle (BIV) lipoplex (LP) technology. Several challenges typically confront shRNA based therapeutics. The most significant challenge is delivery. shRNA is typically delivered through use of a vector, and although they are generally efficient, they pose significant safety concerns. In particular, viral based gene therapy approaches have proved dangerous in past clinical trials. In the first generation of retro viral gene therapy, some patients treated with viral vectors for Wiskott–Aldrich syndrome developed acute T cell leukaemia. This was determined to have been caused by viral vector insertion location. Potential oversaturation of RISC is also a problem. If the shRNA is expressed at levels that are too high, the cell might not be able to correctly process the endogenous RNA which could cause significant problems. Another challenge is the possibility that the patient might mount an immune response against the therapy. Finally, there might be off target effects and the shRNA could silence other unintended genes. In developing successful new shRNA based therapeutics, all of these challenges must be taken into account.