Фаза G2 клеточного цикла: подготовка к митозу.

Введение

Вторая фаза роста в цикле эукариотических клеток, предшествующая митозу.

Фаза G2, фаза Gap 2 или фаза роста 2 — это третья субфаза интерфазы клеточного цикла, непосредственно предшествующая митозу. Она следует за успешным завершением S-фазы, во время которой происходит репликация ДНК клетки. Фаза G2 заканчивается с началом профазы, первой фазы митоза, в которой хроматин клетки конденсируется в хромосомы. Фаза G2 — это период быстрого роста клеток и синтеза белка, в течение которого клетка готовится к митозу. Любопытно, что фаза G2 не является обязательной частью клеточного цикла, поскольку некоторые типы клеток (особенно молодые эмбрионы ксенопуса и некоторые виды рака) переходят непосредственно от репликации ДНК к митозу. Хотя многое известно о генетической сети, регулирующей фазу G2 и последующий вход в митоз, многое еще предстоит узнать о ее значении и регуляции, особенно в отношении рака. Одна из гипотез заключается в том, что рост в фазе G2 регулируется как метод контроля размера клеток. Ранее было показано, что фиссионные дрожжи (Schizosaccharomyces pombe) используют такой механизм посредством пространственной регуляции активности Wee1, опосредованной Cdr2. Хотя Wee1 является достаточно консервативным отрицательным регулятором начала митоза, общий механизм контроля размера клеток в фазе G2 пока не установлен. Биохимически, конец фазы G2 наступает, когда достигается пороговый уровень активного комплекса циклина B1/CDK1, также известного как фактор, способствующий созреванию (MPF). Активность этого комплекса строго регулируется в течение фазы G2. В частности, контрольная точка G2 останавливает клетки в фазе G2 в ответ на повреждение ДНК посредством ингибирующей регуляции CDK1.

Гомологичный рекомбинационный ремонт

Во время S-фазы митоза репликация ДНК производит две почти идентичные сестринские хроматиды. Разрывы двойных цепей ДНК, возникающие после завершения репликации или в фазу G2, могут быть восстановлены до начала деления клетки (M-фаза клеточного цикла). Таким образом, в фазу G2 разрывы двойных цепей в одной сестринской хроматиде могут быть устранены посредством гомологичного рекомбинационного восстановления, используя другую, неповрежденную сестринскую хроматиду в качестве матрицы.

Конец G2/вступление в митоз

Митотический вход определяется пороговым уровнем активного комплекса циклина B1/CDK1, также известного как циклин B1/Cdc2 или фактор, стимулирующий созревание (MPF). Активный циклин B1/CDK1 запускает необратимые процессы в начале митоза, включая разделение центросом, распад ядерной оболочки и сборку веретена деления. У позвоночных существует пять изоформ циклина B (B1, B2, B3, B4 и B5), однако специфическая роль каждой из этих изоформ в регуляции митотического входа до сих пор не установлена. Известно, что циклин B1 может компенсировать потерю как циклина B2 (и наоборот у дрозофилы). Saccharomyces cerevisiae содержит шесть циклинов типа B (Clb1-6), при этом Clb2 является наиболее существенным для функционирования. Как у позвоночных, так и у S. cerevisiae, предполагается, что наличие нескольких циклинов типа B позволяет различным циклинам регулировать разные этапы перехода G2/M, а также обеспечивает устойчивость этого перехода к нарушениям. Дальнейшее обсуждение будет посвящено пространственной и временной активации циклина B1/CDK в клетках млекопитающих, однако аналогичные механизмы применимы как к другим многоклеточным организмам, так и к S. cerevisiae.

Синтез и деградация циклина B1

Уровни циклина B1 подавляются в течение фаз G1 и S комплексом, стимулирующим анафазу (APC), E3 убиквитин-лигазой, которая направляет циклин B1 к протеолизу. Транскрипция начинается в конце S-фазы после репликации ДНК в ответ на фосфорилирование транскрипционных факторов, таких как NF Y, FoxM1 и B Myb, комплексами циклин-зависимых киназ (CDK) фаз G1 и G1/S.

Регулирование активности циклина-B1/CDK1

Повышенные уровни циклина B1 приводят к увеличению концентрации комплексов циклина B1-CDK1 на протяжении G2, однако комплекс остается неактивным до перехода G2/M из-за ингибирующего фосфорилирования киназами Wee1 и Myt1. Wee1 локализуется преимущественно в ядре и воздействует на сайт Tyr15, в то время как Myt1 локализуется на внешней поверхности ЭР и преимущественно воздействует на сайт Thr14. Действию Wee1 и Myt1 противодействуют фосфатазы семейства cdc25, которые удаляют ингибирующие фосфаты с CDK1 и тем самым превращают комплекс циклина B1-CDK1 в его полностью активированную форму, MPF. Активный циклин B1-CDK1 фосфорилирует и модулирует активность Wee1, а также изоформ Cdc25 A и C. В частности, фосфорилирование CDK1 ингибирует киназную активность Wee1, активирует фосфатазную активность Cdc25C посредством активации промежуточной киназы PLK1 и стабилизирует Cdc25A. Таким образом, CDK1 формирует петлю положительной обратной связи с Cdc25 и петлю двойной отрицательной обратной связи с Wee1 (по сути, результирующую петлю положительной обратной связи).

Положительная обратная связь и переключательная активация

Эти положительные обратные связи кодируют гистерический бистабильный переключатель в активности CDK1 относительно уровней циклина B1 (см. рисунок). Этот переключатель характеризуется двумя различными стабильными равновесиями в бистабильной области концентраций циклина B1. Одно равновесие соответствует интерфазе и характеризуется неактивностью циклина B1/CDK1 и Cdc25, а также высоким уровнем активности Wee1 и Myt1. Другое равновесие соответствует M-фазе и характеризуется высокой активностью циклина B1/CDK1 и Cdc25, а низкой активностью Wee1 и Myt1. В пределах диапазона бистабильности состояние клетки зависит от того, находилась ли она ранее в интерфазе или в M-фазе: пороговая концентрация для входа в M-фазу выше минимальной концентрации, необходимой для поддержания активности M-фазы после выхода клетки из интерфазы. Ученые как теоретически, так и экспериментально подтвердили бистабильный характер перехода G2/M. Модель Новака-Тайсона показывает, что дифференциальные уравнения, моделирующие цикл обратной связи циклина B/CDK1, cdc25, Wee1 и Myt1, допускают два стабильных равновесия в диапазоне концентраций циклина B. Экспериментально бистабильность была подтверждена путем блокирования эндогенного синтеза циклина B1 и титрования межфазных и M-фазных клеток варьирующимися концентрациями недеградируемого циклина B1. Эти эксперименты показали, что пороговая концентрация для входа в M-фазу выше, чем пороговая концентрация для выхода из M-фазы: разрушение ядерной оболочки происходит при концентрациях циклина B1 от 32 до 40 нМ для клеток, выходящих из интерфазы, в то время как ядро остается дезинтегрированным при концентрациях выше 16-24 нМ в клетках, уже находящихся в M-фазе. Этот бистабильный, гистерический переключатель физиологически необходим по крайней мере по трем причинам. Во-первых, переход G2/M сигнализирует о начале нескольких событий, таких как конденсация хромосом и разрушение ядерной оболочки, которые значительно изменяют морфологию клетки и возможны только в делящихся клетках. Поэтому важно, чтобы активация циклина B1/CDK1 происходила скачкообразно; то есть клетки должны быстро переходить в дискретное состояние M-фазы после перехода и не должны оставаться в континууме промежуточных состояний (например, с частично разрушенной ядерной оболочкой). Это требование удовлетворяется резким разрывом, разделяющим уровни равновесия активности CDK1 в интерфазе и M-фазе: по мере увеличения концентрации циклина B за пределы порога активации клетка быстро переключается в равновесие M-фазы. Во-вторых, также важно, чтобы переход G2/M происходил однонаправленно, то есть только один раз за клеточный цикл. Биологические системы по своей природе зашумлены, и небольшие колебания концентрации циклина B1 вблизи порога перехода G2/M не должны приводить к переключению клетки между состояниями интерфазы и M-фазы. Это обеспечивается бистабильным характером переключателя: после перехода клетки в состояние M-фазы небольшое снижение концентрации циклина B не вызывает возврата клетки в интерфазу. Наконец, продолжение клеточного цикла требует устойчивых колебаний активности циклина B/CDK1, поскольку клетка и ее потомки переходят в M-фазу и выходят из нее. Отрицательная обратная связь обеспечивает один из важнейших элементов этих долгосрочных колебаний: циклин B/CDK активирует APC/C, что вызывает деградацию циклина B с метафазы и далее, восстанавливая CDK1 в неактивное состояние. Однако простые петли отрицательной обратной связи приводят к затухающим колебаниям, которые в конечном итоге стабилизируются. Кинетические модели показывают, что петли отрицательной обратной связи в сочетании с бистабильными мотивами положительной обратной связи могут приводить к устойчивым, незатухающим колебаниям (см. релаксационный осциллятор), необходимым для долгосрочного клеточного цикла.

These positive feedback loops encode a hysteretic bistable switch in CDK1 activity relative to cyclin B1 levels (see figure). This switch is characterized by two distinct stable equilibria over a bistable region of cyclin B1 concentrations. One equilibrium corresponds to interphase and is characterized by inactivity of Cyclin B1/CDK1 and Cdc25, and a high level of Wee1 and Myt1 activity. The other equilibrium corresponds to M phase and is characterized by high activity of Cyclin B1/CDK1 and Cdc25, and low Wee1 and Myt1 activity. Within the range of bistability, a cell’s state depends upon whether it was previously in interphase or M phase: the threshold concentration for entering M phase is higher than the minimum concentration that will sustain M phase activity once a cell has already exited interphase. Scientists have both theoretically and empirically validated the bistable nature of the G2/M transition. The Novak Tyson model shows that the differential equations modelling the cyclin B/CDK1 cdc25 Wee1 Myt1 feedback loop admit two stable equilibria over a range of cyclin B concentrations. Experimentally, bistability has been validated by blocking endogenous cyclin B1 synthesis and titrating interphase and M phase cells with varying concentrations of non degradable cyclin B1. These experiments show that the threshold concentration for entering M phase is higher than the threshold for exiting M phase: nuclear envelope break down occurs between 32 40 nm cyclin B1 for cells exiting interphase, while the nucleus remains disintegrated at concentrations above 16 24 nm in cells already in M phase. This bistable, hysteretic switch is physiologically necessary for at least three reasons. First, the G2/M transition signals the initiation of several events, such as chromosome condensation and nuclear envelope breakdown, that markedly change the morphology of the cell and are only viable in dividing cells. It is therefore essential that cyclin B1/CDK1 activation occurs in a switch like manner; that is, cells should rapidly settle into a discrete M phase state after the transition, and should not persist in a continuum of intermediate states (e. g., with a partially decomposed nuclear envelope). This requirement is satisfied by the sharp discontinuity separating the interphase and M phase equilibrium levels of CDK1 activity; as the cyclin B concentration increases beyond the activation threshold, the cell rapidly switches to the M phase equilibrium. Secondly, it is also vital that the G2/M transition occur unidirectionally, or only once per cell cycle Biological systems are inherently noisy, and small fluctuations in cyclin B1 concentrations near the threshold for the G2/M transition should not cause the cell to switch back and forth between interphase and M phase states. This is ensured by the bistable nature of the switch: after the cell transitions to the M phase state, small decreases in the concentration of cyclin B do not cause the cell to switch back to interphase. Finally, the continuation of the cell cycle requires persisting oscillations in cyclin B/CDK1 activity as the cell and its descendants transition in and out of M phase. Negative feedback provides one essential element of this long term oscillation: cyclin B/CDK activates APC/C, which causes degradation of cyclin B from metaphase onwards, restoring CDK1 to its inactive state. However, simple negative feedback loops lead to damped oscillations that eventually settle on a steady state. Kinetic models show that negative feedback loops coupled with bistable positive feedback motifs can lead to persistent, non damped oscillations (see relaxation oscillator) of the kind required for long term cell cycling.

Положительная обратная связь

Упомянутая выше положительная обратная связь, в которой циклин B1/CDK1 способствует собственной активации, ингибируя Wee1 и Myst1 и активируя cdc25, не содержит встроенного механизма "запуска" для инициирования этой обратной связи. Недавно появились данные, свидетельствующие о более важной роли комплексов циклина A2/CDK в регулировании начала этого переключения. Активность циклина A2/CDK2 начинается в начале S-фазы и возрастает в течение G2. Показано, что Cdc25B дефосфорилирует Tyr15 на CDK2 в начале и середине G2 аналогичным образом, как описанный выше механизм CDK1. Понижение уровня циклина A2 в клетках U2OS задерживает активацию циклина B1/CDK1, увеличивая активность Wee1 и снижая активность Plk1 и Cdc25C. Однако комплексы циклина A2/CDK не действуют исключительно как активаторы циклина B1/CDK1 в G2, поскольку CDK2 необходим для активации p53-независимой активности контрольной точки G2, возможно, посредством стабилизирующего фосфорилирования Cdc6. Клетки с дефицитом CDK2 также демонстрируют аномально высокие уровни Cdc25A. Также было показано, что циклин A2/CDK1 опосредует протеасомное разрушение Cdc25B. Эти пути часто нарушаются при раке, в то время как активные комплексы циклина B1/CDK1 секвестрируются в цитоплазме 14-3-3σ. Gadd45 нарушает связывание циклина B1 и CDK1 посредством прямого взаимодействия с CDK1. P53 также непосредственно транскрипционно подавляет CDK1.

Медицинская значимость

Мутации в нескольких генах, участвующих в переходе G2/M, вовлечены во многие виды рака. Повышенная экспрессия как циклинов B, так и CDK1, часто возникающая вследствие потери опухолевых супрессоров, таких как p53, может приводить к увеличению пролиферации клеток. Другие попытки модулировать переход G2/M для целей химиотерапии были направлены на контрольную точку повреждения ДНК. Фармакологическое обхождение контрольной точки G2/M посредством ингибирования Chk1 было показано как усиливающее цитотоксичность других химиотерапевтических препаратов. Обход контрольной точки приводит к быстрому накоплению деструктивных мутаций, что, как считается, индуцирует апоптоз в раковых клетках. В то же время, попытки продлить арест в фазе G2/M также показали способность усиливать цитотоксичность препаратов, таких как доксорубицин. Эти подходы находятся на клинических и доклинических стадиях исследований.