Фиколл и Фиколл-Паке: применение в разделении крови и выделении клеток.

Введение

Фиколл – нейтральный, сильно разветвленный, гидрофильный полисахарид с высокой молекулярной массой, который легко растворяется в водных растворах. Радиус частиц Фиколла варьируется от 2 до 7 нм. Он получают путем реакции полисахарида с эпихлоргидрином. Ficoll – зарегистрированный товарный знак, принадлежащий компаниям GE Healthcare. Фиколл входит в состав Ficoll Paque, который используется в биологических лабораториях для разделения крови на компоненты (эритроциты, лейкоциты и т.д.). Ficoll Paque обычно помещают на дно конической пробирки, а затем медленно наносят поверх него слой крови. После центрифугирования в конической пробирке сверху вниз будут видны следующие слои: плазма и другие составляющие, слой мононуклеарных клеток, называемый лейкоцитарным слоем (PBMC/MNC), Ficoll Paque, и эритроциты и гранулоциты, которые должны присутствовать в виде осадка. Такое разделение позволяет легко выделять PBMC. Следует отметить, что в слое PBMC или Ficoll Paque может наблюдаться улавливание эритроцитов (присутствие эритроцитов и гранулоцитов). В слое PBMC иногда может возникать значительное свертывание крови. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и гепарин обычно используются в сочетании с Ficoll Paque (TM) для предотвращения свертывания и в качестве сепаратора мононуклеарных клеток. В ранних исследованиях по лечению диабета трансплантацией Фиколл применяли в попытке отделить островки Лангерганса от ткани поджелудочной железы человека, обработанной ферментом (коллагеназой). Предполагалось, что выделенные островки можно будет использовать для трансплантации пациентам с диабетом 1 типа. Однако на практике использование Фиколла приводило к трудностям в получении достаточно чистого препарата островков с достаточным выходом из исходной ткани для безопасной и эффективной трансплантации островков человеку. Поскольку нанесение слоев Ficoll Paque – довольно медленный процесс, были разработаны устройства, облегчающие самый трудоемкий этап – нанесение слоя. Одним из таких продуктов является SepMate 50 – специальная пробирка, содержащая пористую вставку, которая создает физический барьер между Ficoll Paque и образцом крови. Это позволяет быстро пипетировать образец крови на вставку, избегая необходимости наносить его непосредственно на Ficoll Paque. Вставка SepMate также сокращает время центрифугирования, и после центрифугирования верхний слой, содержащий плазму и PBMC, можно перелить в новую пробирку. Другие устройства включают колонку с пористым барьером из полиэтилена высокой плотности или "фритой". Эти продукты позволяют значительно ускорить нанесение слоев крови без смешивания полисахарида и крови. Примером такого продукта является "Accuspin System Histopaque 1077", продаваемый компанией Sigma Aldrich. Стоимость этого продукта значительно выше, чем у базовых продуктов Ficoll и Ficoll Paque. Также возможно включение системы разделения Ficoll Paque в пробирки Vacutainer, используемые для сбора крови. Такие пробирки Vacutainer повышают удобство и безопасность сбора продуктов крови, но стоят в 50 раз дороже, чем базовые пробирки Vacutainer.

Ficoll is a neutral, highly branched, high mass, hydrophilic polysaccharide which dissolves readily in aqueous solutions. Ficoll radii range from 2 to 7 nm. It is prepared by reaction of the polysaccharide with epichlorohydrin. Ficoll is a registered trademark owned by GE Healthcare companies. Ficoll is part of Ficoll Paque, which is used in biology laboratories to separate blood to its components (erythrocytes, leukocytes etc.). Ficoll Paque is normally placed at the bottom of a conical tube, and blood is then slowly layered above Ficoll Paque. After being centrifuged, the following layers will be visible in the conical tube, from top to bottom: plasma and other constituents, a layer of mono nuclear cells called buffy coat (PBMC/MNC), Ficoll Paque, and erythrocytes and granulocytes, which should be present in pellet form. This separation allows easy harvest of PBMCs. Note that some red blood cell trapping (presence of erythrocytes and granulocytes) may occur in the PBMC or Ficoll Paque layer. Major blood clotting may sometimes occur in the PBMC layer. Ethylene diamine tetra acetate (EDTA) and heparin are commonly used in conjunction with Ficoll Paque(TM) to prevent clotting and is used as a mononuclear cell separator. At one time, fairly early in the research for diabetes treatment by transplantation, Ficoll was used in an attempt to separate islets of Langerhans from enzyme (collagenase) digested human pancreatic tissue. The theory was that separated islets could then be used for transplantation into patients with type 1 diabetes. In practice, using Ficoll led to difficulty obtaining a pure enough preparation of islets, with enough islet recovery from the original tissue, for safe and effective islet transplantation in humans. Because Ficoll Paque layering is a very slow process, devices that aid in the most time consuming step, the overlay, have been developed. One such product is SepMate 50, a specialized tube containing a porous insert that forms a physical barrier between the Ficoll Paque and blood sample. This allows the blood sample to be rapidly pipetted onto the insert, avoiding the need for overlaying it directly onto Ficoll Paque. The SepMate insert also reduces the duration of the centrifugation step, and after centrifugation, the top layer containing plasma and PBMCs can be poured into a new tube. Other devices include a column containing a porous high density polyethylene barrier or "frit." These products allow blood to be layered on much more quickly without mixing polysaccharide and blood. An example of such a product is the "Accuspin System Histopaque 1077" sold by Sigma Aldrich. The cost of this product is significantly higher than basic Ficoll and Ficoll Paque products. It is also possible to have the Ficoll Paque separating system included in the Vacutainer used to collect the blood. Such Vacutainers increase the convenience and safety of collecting blood products, but cost 50 times as much as the basic Vacutainer.