Введение

Гликозид-гидролазные ферменты, расщепляющие гликозидные связи нейраминиковых кислот.

Экзо α-сиалидаза (сиалидаза, нейраминидаза; систематическое название – ацетилнеураминилгидролаза) – это гликозид-гидролаза, расщепляющая гликозидные связи нейраминиковых кислот:

Гидролиз α (2→3), α (2→6), α (2→8) гликозидных связей терминальных остатков сиаловой кислоты в олигосахаридах, гликопротеинах, гликолипидах, коломиниковой кислоте и синтетических субстратах.

Нейраминидазы – это большое семейство ферментов, встречающееся у широкого спектра организмов. Наиболее известна вирусная нейраминидаза, являющаяся мишенью для лекарственных препаратов, используемых для предотвращения распространения инфекции гриппа. Вирусная нейраминидаза была первой идентифицированной нейраминидазой. Она была открыта в 1957 году Альфредом Готтшалком в Институте Уолтера и Элизы Холл в Мельбурне. Вирусные нейраминидазы часто используются в качестве антигенных детерминант, находящихся на поверхности вируса гриппа. Некоторые варианты нейраминидазы гриппа придают вирусу большую вирулентность, чем другие. Другие гомологи обнаружены в клетках млекопитающих, где выполняют различные функции. В геноме человека описано как минимум четыре гомолога сиалидазы млекопитающих (см. NEU1, NEU2, NEU3, NEU4). Сиалидазы могут выступать в роли патогенных факторов при микробных инфекциях.

Структура

Грипповая нейраминидаза – это грибовидный вырост на поверхности вируса гриппа. Она имеет головку, состоящую из четырех сопланарных и приблизительно сферических субъединиц, и гидрофобную область, встроенную во внутреннюю часть вирусной мембраны. Нейраминидаза состоит из единой полипептидной цепи, ориентированной в направлении, противоположном антигену гемагглютинина. Полипептид состоит из единой цепи из шести консервативных полярных аминокислот, за которой следуют гидрофильные, вариабельные аминокислоты. В качестве вторичной структуры белка преобладают β-листы. Структура транссиалидазы включает каталитический β-пропеллерный домен, N-концевой лектиноподобный домен и неправильный β-слойчатый домен, вставленный в каталитический домен. Недавнее появление штаммов вируса гриппа A(H1N1) H274Y, устойчивых к озельтамивиру и занамивиру, подчеркнуло необходимость в подходящих системах экспрессии для получения больших количеств высокочистой и стабильной рекомбинантной нейраминидазы посредством двух отдельных искусственных доменов тетрамеризации, которые облегчают формирование каталитически активных нейраминидазных гомотетрамеров из дрожжей и *Staphylothermus marinus*, обеспечивая секрецию белков, меченных FLAG, и последующую очистку.

Механизм

Энзиматический механизм сиалидазы вируса гриппа был изучен Тейлором и др., что показано на рисунке 1. Процесс ферментативного катализа состоит из четырех стадий. Первая стадия включает деформацию α-сиалозида из конформации 2C5-кресла (формы с наименьшей энергией в растворе) в псевдолодочную конформацию при связывании сиалозида с сиалидазой. Вторая стадия приводит к образованию оксокарбокатионного интермедиата – сиалозил-катиона. Третья стадия – формирование Neu5Ac сначала в виде α-аномера, затем мутаротация и высвобождение в виде более термодинамически стабильного β Neu5Ac.

Ингибиторы

Ингибиторы нейраминидазы эффективны в борьбе с инфекцией гриппа: занамивир, вводимый ингаляционно; озельтамивир, вводимый перорально; переамивир, вводимый парентерально, то есть внутривенно или внутримышечно; и ланаминамивир, находящийся на стадии III клинических испытаний. На поверхности частиц вируса гриппа присутствуют два основных белка. Один из них – белок гемагглютинина-лектина с тремя относительно неглубокими участками связывания сиаловой кислоты, а другой – фермент сиалидаза с активным центром, расположенным в углублении. Благодаря относительно глубокому активному центру, в котором ингибиторы с низкой молекулярной массой могут образовывать множество благоприятных взаимодействий, и доступности методов разработки аналогов переходного состояния при гидролизе сиалозидов, сиалидаза является более привлекательной мишенью для противогриппозных препаратов, чем гемагглютинин. После получения рентгеноструктурных данных нескольких сиалидаз вируса гриппа, дизайн ингибиторов на основе структуры был применен для обнаружения мощных ингибиторов этого фермента. Производное ненасыщенной сиаловой кислоты (N-ацетилнейраминовой кислоты [Neu5ac]) – 2-дезокси-2,3-дидегидро-D-N-ацетилнейраминовая кислота (Neu5Ac2en) – аналог сиалозил-катионного переходного состояния (рисунок 2), считается наиболее перспективным структурным ядром ингибитора. Структурно модифицированные производные Neu5Ac2en могут обладать большей эффективностью. Многие соединения на основе Neu5Ac2en были синтезированы и протестированы на предмет их способности ингибировать сиалидазу вируса гриппа. Например: 4-замещенные производные Neu5Ac2en (рисунок 3), 4-амино-Neu5Ac2en (соединение 1), продемонстрировавшие ингибирование сиалидазы вируса гриппа в два порядка величин лучше, чем у Neu5Ac2en, и 4-гуанидино-Neu5Ac2en (соединение 2), известный как занамивир, который в настоящее время используется в качестве лекарственного средства для лечения гриппа, были разработаны фон Ицштейном и его коллегами. Серия Neu5Ac2en, модифицированных в положении C9 амидной связью, была описана Мегешем и его соавторами в качестве ингибиторов NEU1.