Эксперимент Люрии-Дельбрюка: Случайность мутаций у бактерий.

Введение

Эксперимент Лурии–Дельбрюка (1943) (также называемый тестом на флуктуации) показал, что у бактерий генетические мутации возникают до начала действия селективного давления, а не являются ответом на него. Таким образом, было сделано заключение, что теория Дарвина об естественном отборе, действующем на случайные мутации, применима как к бактериям, так и к более сложным организмам. Макс Дельбрюк и Сальвадор Лурия были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине в 1969 году, в том числе за эту работу.

История

К 1940-м годам представления о наследственности и мутациях были в целом приняты, хотя роль ДНК как носителя наследственной информации еще не была установлена. Считалось, что бактерии отличаются от других организмов и способны приобретать наследственные генетические мутации в зависимости от условий среды: другими словами, являются ли мутации в бактериях предсуществующими (преадаптивными) или возникают как направленная адаптация (постадаптивными)? В своем эксперименте Лурия и Дельбрюк внесли небольшое количество бактерий (Escherichia coli) в отдельные пробирки с культуральной средой. После периода роста они высеяли равные объемы этих отдельных культур на агар, содержащий фаг T1 (вирус). Если устойчивость бактерий к вирусу обусловлена индуцированной активацией, то есть не связана с наследственными генетическими компонентами, то на каждой пластинке должно было бы наблюдаться примерно одинаковое количество устойчивых колоний. Исходя из предположения о постоянной скорости мутаций, Лурия предположил, что если мутации возникают после и в ответ на воздействие селективного агента, то число выживших будет распределено по распределению Пуассона, где среднее значение равно дисперсии. Однако Дельбрюк и Лурия обнаружили, что число устойчивых колоний на каждой пластинке значительно варьировало: дисперсия оказалась существенно больше среднего значения. Лурия и Дельбрюк предположили, что эти результаты можно объяснить постоянной скоростью случайных мутаций в каждом поколении бактерий, растущих в исходных пробирках. На основе этих предположений Дельбрюк вывел вероятностное распределение (ныне известное как распределение Лурии–Дельбрюка), которое устанавливает связь между моментами, согласующуюся с экспериментально полученными значениями. Таким образом, был сделан вывод, что мутации в бактериях, как и в других организмах, являются случайными, а не направленными. Результаты Лурии и Дельбрюка были подтверждены Ньюкомбом в более наглядной, но менее количественной форме. Ньюкомб инкубировал бактерии в чашке Петри в течение нескольких часов, а затем реплицировал культуру на две новые чашки Петри, обработанные фагом. Первую чашку оставили нераспространенной, а вторую – рассеяли, то есть переместили бактериальные клетки, позволив отдельным клеткам в некоторых колониях образовать собственные новые колонии. Если колонии содержали устойчивые бактериальные клетки до контакта с вирусом-фагом, следовало ожидать, что некоторые из этих клеток сформируют новые устойчивые колонии на рассеянной чашке, и, следовательно, там будет обнаружено большее количество выживших бактерий. После инкубации обеих чашек на рассеянной чашке оказалось в 50 раз больше бактериальных колоний. Это показало, что мутации бактерий, обеспечивающие устойчивость к вирусу, произошли случайным образом в ходе первой инкубации. Таким образом, мутации возникли до применения селективного давления. В последнее время результаты Лурии и Дельбрюка были подвергнуты сомнению Кернсом и другими исследователями, изучавшими мутации в метаболизме сахаров как форму экологического стресса. Некоторые ученые предполагают, что этот результат мог быть вызван отбором в пользу амплификации генов и/или более высокой скорости мутаций в клетках, не способных к делению. Другие защищают проведенное исследование и предлагают механизмы, объясняющие наблюдаемые явления, согласующиеся с адаптивным мутагенезом. По-видимому, это распределение было впервые определено Холданом. В 1991 году в Университетском колледже Лондона была обнаружена неопубликованная рукопись, описывающая это распределение. Выводка отличается, но результаты сложно вычислить без использования компьютера.

By the 1940s the ideas of inheritance and mutation were generally accepted, though the role of DNA as the hereditary material had not yet been established. It was thought that bacteria were somehow different and could develop heritable genetic mutations depending on the circumstances they found themselves: in short, was the mutation in bacteria pre adaptive (pre existent) or post adaptive (directed adaption)? In their experiment, Luria and Delbrück inoculated a small number of bacteria (Escherichia coli) into separate culture tubes. After a period of growth, they plated equal volumes of these separate cultures onto agar containing the T1 phage (virus). If resistance to the virus in bacteria were caused by an induced activation in bacteria i. e. if resistance were not due to heritable genetic components, then each plate should contain roughly the same number of resistant colonies. Assuming a constant rate of mutation, Luria hypothesized that if mutations occurred after and in response to exposure to the selective agent, the number of survivors would be distributed according to a Poisson distribution with the mean equal to the variance. This was not what Delbrück and Luria found: Instead the number of resistant colonies on each plate varied drastically: the variance was considerably greater than the mean. Luria and Delbrück proposed that these results could be explained by the occurrence of a constant rate of random mutations in each generation of bacteria growing in the initial culture tubes. Based on these assumptions Delbrück derived a probability distribution (now called the Luria–Delbrück distribution) that gives a relationship between moments consistent with the experimentally obtained values. Therefore, the conclusion was that mutations in bacteria, as in other organisms, are random rather than directed. The results of Luria and Delbrück were confirmed in more graphical, but less quantitative, way by Newcombe. Newcombe incubated bacteria in a Petri dish for a few hours, then replica plated it onto two new Petri dishes treated with phage. The first plate was left unspread, and the second plate was then respread, that is, bacterial cells were moved around allowing single cells in some colony to form their own new colonies. If colonies contained resistant bacterial cells before entering into contact with the phage virus, one would expect that some of these cells would form new resistant colonies on the respread dish and so to find a higher number of surviving bacteria there. When both plates were incubated for growth, there were actually as much as 50 times greater number of bacterial colonies on the respread dish. This showed that bacterial mutations to virus resistance had randomly occurred during the first incubation. Once again, the mutations occurred before selection was applied. More recently, the results of Luria and Delbrück were questioned by Cairns and others, who studied mutations in sugar metabolism as a form of environmental stress. Some scientists suggest that this result may have been caused by selection for gene amplification and/or a higher mutation rate in cells unable to divide. Others have defended the research and propose mechanisms which account for the observed phenomena consistent with adaptive mutagenesis. This distribution appears to have been first determined by Haldane. An unpublished manuscript was discovered in 1991 at University College London describing this distribution. The derivation is different but the results are difficult to compute without the use of a computer.

Молекулярная биология

Механизм устойчивости к фагу T1, по-видимому, был обусловлен мутациями в гене *fhuA* – ген, кодирующий мембранный белок, функционирующий как рецептор для фага T1. Продукт гена *tonB* также необходим для инфекции фагом T1. Белок FhuA активно участвует в транспорте феррихрома, альбомицина и рифамицина. Он также обуславливает чувствительность к микроцину J25 и колицину M, а также служит рецептором для фагов T5, phi80 и T1. Белок FhuA содержит бета-баррельный домен (остатки 161–714), который закрыт глобулярным пробковым доменом (остатки 1–160). Внутри пробкового домена находится область связывания с TonB (остатки 7–11). Крупные мембранные мономерные β-барельные домены состоят из 22 β-цепей различной длины, некоторые из которых значительно выступают за пределы гидрофобного ядра мембраны во внеклеточное пространство. Существует 11 внеклеточных петель, пронумерованных от L1 до L11. Фаг T1 связывается с петлей L4.