Гидрогеназы: структура, функции и перспективы использования.

Введение

Гидрогеназа – это фермент, который катализирует обратимое окисление молекулярного водорода (H2), как показано ниже:

Поглощение водорода связано с восстановлением акцепторов электронов, таких как кислород, нитрат, сульфат, диоксид углерода и фумарат. С другой стороны, восстановление протонов связано с окислением доноров электронов, таких как ферредоксин (FNR), и служит для утилизации избыточных электронов в клетках (важно при пируватно́м брожении). Как низкомолекулярные соединения, так и белки, такие как FNR, цитохром c3 и цитохром c6, могут выступать в качестве физиологических доноров или акцепторов электронов для гидрогеназ.

Структурная классификация

По оценкам, 99% всех организмов используют водород, H2. Большинство из этих видов – микробы, и их способность использовать H2 в качестве метаболита обусловлена экспрессией металлосодержащих ферментов, известных как гидрогеназы. Гидрогеназы подразделяются на три различных типа в зависимости от состава металла в активном центре: железо-железная гидрогеназа, никель-железная гидрогеназа и железная гидрогеназа. Гидрогеназы катализируют, иногда обратимо, поглощение H2. Гидрогеназы [FeFe] и [NiFe] являются истинными редокс-катализаторами, обеспечивающими окисление H2 и восстановление протонов (H+) (уравнение), а гидрогеназы [Fe] катализируют обратимое гетеролитическое расщепление H2, показанное в реакции. Хотя изначально считалось, что они "не содержат металлов", гидрогеназы, содержащие только [Fe], содержат Fe в активном центре и не содержат железосерных кластеров. Гидрогеназы [NiFe] и [FeFe] имеют некоторые общие черты в своей структуре: каждый фермент имеет активный центр и несколько FeS-кластеров, находящихся внутри белка. Активный центр, который, как считается, является местом катализа, также представляет собой металлосодержащий кластер, и каждый атом железа координирован лигандами окиси углерода (CO) и цианида (CN−).

[NiFe] гидрогеназа

Гидрогеназы [NiFe] представляют собой гетеродимерные белки, состоящие из малых (S) и больших (L) субъединиц. Малая субъединица содержит три железосерные кластеры, а большая субъединица – активный центр, никель-железный центр, соединенный с растворителем посредством молекулярного туннеля. Как и [FeFe] гидрогеназы, [NiFe] гидрогеназы обычно деактивируются молекулярным кислородом (O2). Гидрогеназа из Ralstonia eutropha и несколько других так называемых бактерий Knallgas оказались кислородоустойчивыми. Растворимую [NiFe] гидрогеназу из Ralstonia eutropha H16 можно удобно получать в гетеротрофных средах культивирования. Это открытие вселило надежду на возможность использования гидрогеназ в фотосинтетическом производстве молекулярного водорода путем расщепления воды. Другая [NiFe] гидрогеназа, известная как Huc или Hyd1, или гидрогеназа цианобактериального типа, поглощающая водород, оказалась нечувствительной к кислороду, при этом обладая очень высоким сродством к водороду. Водород способен проникать в узкие каналы фермента, недоступные для молекул кислорода. Это позволяет бактериям, таким как Mycobacterium smegmatis, использовать небольшое количество водорода в атмосфере в качестве источника энергии при недостатке других источников.

[FeFe] гидрогеназа

Гидрогеназы, содержащие дижелезный центр с мостовым дитиолатным кофактором, называются [FeFe] гидрогеназами. Выделяют три семейства [FeFe] гидрогеназ: цитоплазматические, растворимые, мономерные гидрогеназы, обнаруженные у строгих анаэробов, таких как Clostridium pasteurianum и Megasphaera elsdenii. Они катализируют как выделение, так и поглощение H2. Периплазматические, гетеродимерные гидрогеназы из Desulfovibrio spp., которые могут быть очищены в аэробных условиях. Растворимые, мономерные гидрогеназы, обнаруженные в хлоропластах зеленых водорослей Scenedesmus obliquus, катализируют выделение H2. [Fe2S2] ферредоксин функционирует как естественный донор электронов, связывающий фермент с фотосинтетической цепью переноса электронов. В отличие от [NiFe] гидрогеназ, [FeFe] гидрогеназы обычно более активны в производстве молекулярного водорода. В литературе сообщается о частоте оборота (TOF) порядка 10 000 с−1 для [FeFe] гидрогеназ из Clostridium pasteurianum. Это привело к интенсивным исследованиям, направленным на использование [FeFe] гидрогеназы для устойчивого производства H2. Активный центр дииронгидрогеназы известен как H-кластер. H-кластер состоит из кубической структуры [4Fe4S], соединенной с низковалентным дижелезным кофактором тиолом, производным от цистеина. Дижелезный кофактор включает два атома железа, соединенных мостовым азадитиолатным лигандом (SCH2NHCH2S, adt), атомы железа координированы карбонильными и цианидными лигандами. [FeFe] гидрогеназы можно разделить на четыре различных филогенетических группы A–D. Группа A состоит из прототипических и бифуркационных [FeFe] гидрогеназ. В природе прототипические [FeFe] гидрогеназы осуществляют оборот водорода, используя ферредоксин в качестве редокс-партнера, в то время как бифуркационные типы выполняют ту же реакцию, используя как ферредоксин, так и NAD(H) в качестве донора или акцептора электронов. Для сохранения энергии анаэробные бактерии используют электронную бифуркацию, при которой эксергонические и эндергонические окислительно-восстановительные реакции сопряжены для преодоления термодинамических барьеров. Группа A включает наиболее хорошо охарактеризованные и каталитически наиболее активные ферменты, такие как [FeFe] гидрогеназа из Chlamydomonas reinhardtii (CrHydA1), Desulfovibrio desulfuricans (DdHydAB или DdH) и Clostridium pasteurianum и Clostridium acetobutylicum (CpHydA1 и CaHydA1, обозначаемые как CpI и CaI). Представительных примеров группы B пока не охарактеризовано, но она филогенетически отличается, даже если имеет схожие аминокислотные мотивы вокруг H-кластера, как у [FeFe] гидрогеназ группы A. Группа C была классифицирована как "сенсорная" на основе наличия домена Per-Arnt-Sim. Один пример [FeFe] гидрогеназы группы C из Thermotoga maritima (TmHydS) демонстрирует лишь умеренные каталитические скорости по сравнению с ферментами группы A и очевидную высокую чувствительность к водороду (H2). Тесно связанный подкласс из группы D имеет аналогичное положение на бактериальном гене и схожую структуру доменов с подклассом из группы E, но ему не хватает домена PAS.

The hydrogenases containing a di iron center with a bridging dithiolate cofactor are called [FeFe] hydrogenases. Three families of [FeFe] hydrogenases are recognized:
cytoplasmic, soluble, monomeric hydrogenases, found in strict anaerobes such as Clostridium pasteurianum and Megasphaera elsdenii. They catalyse both H2 evolution and uptake. periplasmic, heterodimeric hydrogenases from Desulfovibrio spp., which can be purified aerobically. soluble, monomeric hydrogenases, found in chloroplasts of green alga Scenedesmus obliquus, catalyses H2 evolution. The [Fe2S2] ferredoxin functions as natural electron donor linking the enzyme to the photosynthetic electron transport chain. In contrast to [NiFe] hydrogenases, [FeFe] hydrogenases are generally more active in production of molecular hydrogen. Turnover frequency (TOF) in the order of 10,000 s−1 have been reported in literature for [FeFe] hydrogenases from Clostridium pasteurianum. This has led to intense research focusing on use of [FeFe] hydrogenase for sustainable production of H2. The active site of the diiron hydrogenase is known as the H cluster. The H cluster consists of a [4Fe4S] cubane shaped structure, coupled to the low valent diiron co factor by a cysteine derived thiol. The diiron co factor includes two iron atoms, connected by a bridging aza dithiolate ligand ( SCH2 NH CH2S , adt), the iron atoms are coordinated by carbonyl and cyanide ligands. [FeFe] hydrogenases can be separated into four distinct phylogenetic groups A−D. Group A consists of prototypical and bifurcating [FeFe] hydrogenases. In nature, prototypical [FeFe] hydrogenases perform hydrogen turnover using ferredoxin as a redox partner while bifurcating types perform the same reaction using both ferredoxin and NAD(H) as electron donor or acceptor. In order to conserve energy, anaerobic bacteria use electron bifurcation where exergonic and endergonic redox reactions are coupled to circumvent thermodynamic barriers. Group A comprises the best characterized and catalytically most active enzymes such as the [FeFe] hydrogenase from Chlamydomonas reinhardtii (CrHydA1), Desulfovibrio desulfuricans (DdHydAB or DdH), and Clostridium pasteurianum and Clostridium acetobutylicum (CpHydA1 and CaHydA1, referred to as CpI and CaI). No representative examples of Group B has been characterized yet but it is phylogenetically distinct even when it shares similar amino acid motifs around the H cluster as Group A [FeFe] hydrogenases. Group C has been classified as "sensory" based on the presence of a Per Arnt Sim domain. One example of a Group C [FeFe] hydrogenase is from Thermotoga maritima (TmHydS) which shows only modest catalytic rates compared to Group A enzymes and an apparent high sensitivity toward hydrogen (H2). A closely related subclass from Group D has a similar location on the bacterial gene and share similar domain structure to a subclass from Group E but it lacks the PAS domain.

[Fe]-только гидрогеназа

5,10-метенилтетрагидрометаноптериновая гидрогеназа (EC 1.12.98.2), обнаруженная в метаногенных археях, не содержит ни никеля, ни железо-серных кластеров, но содержит железосодержащий кофактор, который недавно был охарактеризован методом рентгеноструктурного анализа. В отличие от двух других типов, [Fe]-только гидрогеназы встречаются лишь у некоторых гидрогенотрофных метаногенных архей. Они также характеризуются принципиально иным ферментативным механизмом с точки зрения редокс-партнеров и способа доставки электронов к активному центру. В [NiFe]- и [FeFe]-гидрогеназах электроны перемещаются через ряд металлоорганических кластеров, образующих длинную цепь; структура активного центра остается неизменной на протяжении всего процесса. Однако в [Fe]-только гидрогеназах электроны доставляются непосредственно к активному центру на короткое расстояние. Метенил-H4MPT+, являющийся кофактором, непосредственно принимает гидрид из H2 в ходе реакции. [Fe]-только гидрогеназа также известна как H2-формирующая метилентетрагидрометаноптериновая (метилен-H4MPT) дегидрогеназа, поскольку ее функция заключается в обратимом восстановлении метенил-H4MPT+ до метилен-H4MPT. Гидрогенизация метенил-H4MPT+ происходит вместо окисления/образования H2, что характерно для двух других типов гидрогеназ. Хотя точный механизм катализа все еще изучается, последние данные указывают на то, что молекулярный водород сначала гетеролитически расщепляется Fe(II), после чего происходит перенос гидрида к карбокатиону акцептора.

Механизм

Молекулярный механизм, посредством которого протоны превращаются в молекулы водорода в гидрогеназах, все еще активно изучается. Один из распространенных подходов заключается в использовании мутагенеза для выяснения роли аминокислот и/или лигандов на различных стадиях катализа, таких как внутримолекулярный транспорт субстратов. Например, Корниш и соавторы провели исследования мутагенеза и выяснили, что четыре аминокислоты, расположенные вдоль предполагаемого канала, соединяющего активный центр и поверхность белка, критически важны для ферментативной функции [FeFe]-гидрогеназы из Clostridium pasteurianum (CpI). С другой стороны, можно также опираться на вычислительный анализ и моделирование. Нильсон Лилл и Сигбан недавно применили этот подход для изучения механизма, с помощью которого [NiFe]-гидрогеназы катализируют расщепление H2. Оба подхода взаимодополняемы и могут быть полезны друг для друга. Фактически, Као и Холл объединили оба подхода при разработке модели, описывающей, как молекулы водорода окисляются или образуются в активном центре [FeFe]-гидрогеназ. Хотя для полного понимания механизма необходимы дальнейшие исследования и экспериментальные данные, эти результаты позволили ученым применять полученные знания, например, при создании искусственных катализаторов, имитирующих активные центры гидрогеназ.

Биологическая функция

Предполагая, что атмосфера Земли изначально была богата водородом, ученые выдвигают гипотезу о том, что гидрогеназы эволюционировали для генерации энергии из молекулярного H2. Соответственно, гидрогеназы могут способствовать пролиферации микроорганизмов в таких условиях или создавать экосистемы, функционирующие на основе H2. Микробные сообщества, использующие молекулярный водород, действительно были обнаружены в глубоководных средах, где другие источники энергии от фотосинтеза недоступны. Исходя из этого, считается, что основная роль гидрогеназ заключается в генерации энергии, которой может быть достаточно для поддержания экосистемы. Однако недавние исследования выявили и другие биологические функции гидрогеназ. В частности, двунаправленные гидрогеназы могут выступать в роли "клапанов", регулирующих избыток восстановительных эквивалентов, особенно в фотосинтезирующих микроорганизмах. Такая функция делает гидрогеназы важным элементом анаэробного метаболизма. Более того, гидрогеназы могут участвовать в мембранном сохранении энергии посредством генерации трансмембранного протонного градиента. [15] Существует вероятность того, что гидрогеназы играют роль в биоремедиации хлорированных соединений. Гидрогеназы, эффективно поглощающие H2, могут способствовать восстановлению тяжелых металлов в нетоксичные формы. Эти гидрогеназы, участвующие в поглощении водорода, были недавно обнаружены в патогенных бактериях и паразитах и предположительно связаны с их вирулентностью. [15]

Приложения

Гидрогеназы были впервые обнаружены в 1930-х годах, и с тех пор привлекли внимание многих исследователей, в том числе неорганических химиков, которые синтезировали разнообразные аналоги гидрогеназ. Растворимая [NiFe] гидрогеназа из Ralstonia eutropha H16 является перспективным ферментом-кандидатом для использования в биотопливе на основе H2, поскольку она способствует окислению H2 и относительно устойчива к кислороду. Ее можно получать в гетеротрофных средах для культивирования.

Биологическое производство водорода

Различные системы способны расщеплять воду на O2 и H+ под действием солнечного света. Аналогичным образом, многочисленные катализаторы, химические или биологические, могут восстанавливать полученные H+ в H2. Разным катализаторам требуется разный перенапряжение для протекания этой реакции восстановления. Гидрогеназы привлекательны, поскольку они требуют относительно низкого перенапряжения. Фактически, их каталитическая активность выше, чем у платины – наиболее известного катализатора реакции выделения H2. Среди трех различных типов гидрогеназ, [FeFe] гидрогеназы рассматриваются как перспективный компонент солнечной системы производства H2, поскольку они обладают дополнительным преимуществом – высокой TOF (более 9000 с−1)[6]. Низкое перенапряжение и высокая каталитическая активность [FeFe] гидрогеназ сопровождаются высокой чувствительностью к O2. Для использования в солнечном производстве H2 необходимо модифицировать их, придав устойчивость к O2, поскольку O2 является побочным продуктом реакции расщепления воды. Предыдущие исследования, проведенные различными группами по всему миру, были направлены на понимание механизмов инактивации гидрогеназ кислородом. Например, Stripp и др. использовали электрохимию белковых пленок и обнаружили, что O2 сначала превращается в реактивный вид в активном центре [FeFe] гидрогеназы, а затем повреждает ее [4Fe 4S] домен. Cohen и др. исследовали, каким образом кислород может достигать активного центра, находящегося внутри белковой структуры, с помощью моделирования молекулярной динамики; их результаты показали, что O2 диффундирует в основном по двум путям, формирующимся за счет увеличения и соединения полостей во время динамического движения. Эти работы, в сочетании с другими данными, позволяют предположить, что инактивация определяется двумя явлениями: диффузией O2 к активному центру и деструктивной модификацией активного центра. Несмотря на эти результаты, исследования по повышению кислородоустойчивости гидрогеназ продолжаются. Хотя исследователи обнаружили кислородоустойчивые [NiFe] гидрогеназы, они эффективны только в процессах поглощения водорода, а не в его производстве[21]. Недавний успех Bingham и др. в модификации [FeFe] гидрогеназы из Clostridium pasteurianum также был ограничен сохранением активности (при воздействии кислорода) только для потребления H2.

Various systems are capable of splitting water into O2 and H+ from incident sunlight. Likewise, numerous catalysts, either chemical or biological, can reduce the produced H+ into H2. Different catalysts require unequal overpotential for this reduction reaction to take place. Hydrogenases are attractive since they require a relatively low overpotential. In fact, its catalytic activity is more effective than platinum, which is the best known catalyst for H2 evolution reaction. Among three different types of hydrogenases, [FeFe] hydrogenases is considered as a strong candidate for an integral part of the solar H2 production system since they offer an additional advantage of high TOF (over 9000 s−1)[6]. Low overpotential and high catalytic activity of [FeFe] hydrogenases are accompanied by high O2 sensitivity. It is necessary to engineer them O2 tolerant for use in solar H2 production since O2 is a by product of water splitting reaction. Past research efforts by various groups around the world have focused on understanding the mechanisms involved in O2 inactivation of hydrogenases. For instance, Stripp et al. relied on protein film electrochemistry and discovered that O2 first converts into a reactive species at the active site of [FeFe] hydrogenases, and then damages its [4Fe 4S] domain. Cohen et al. investigated how oxygen can reach the active site that is buried inside the protein body by molecular dynamics simulation approach; their results indicate that O2 diffuses through mainly two pathways that are formed by enlargement of and interconnection between cavities during dynamic motion. These works, in combination with other reports, suggest that inactivation is governed by two phenomena: diffusion of O2 to the active site, and destructive modification of the active site. Despite these findings, research is still under progress for engineering oxygen tolerance in hydrogenases. While researchers have found oxygen tolerant [NiFe] hydrogenases, they are only efficient in hydrogen uptake and not production[21]. Bingham et al. 's recent success in engineering [FeFe] hydrogenase from Clostridium pasteurianum was also limited to retained activity (during exposure to oxygen) for H2 consumption, only.

Биотопливные элементы на основе гидрогеназы

Типичные ферментативные биотопливные элементы предполагают использование ферментов в качестве электрокатализаторов на катоде и аноде, или только на одном из электродов. В биотопливных элементах на основе гидрогеназы ферменты гидрогеназы присутствуют на аноде для окисления H2.

Принцип

Двунаправленная или обратимая реакция, катализируемая гидрогеназой, позволяет накапливать и хранить возобновляемую энергию в виде топлива с возможностью использования по мере необходимости. Это можно продемонстрировать на примере химического хранения электроэнергии, полученной из возобновляемых источников (например, солнечной, ветровой, гидротермальной), в форме H2 в периоды низкого потребления энергии. При необходимости, H2 может быть окислен для выработки электроэнергии.

Преимущества

Это одно из решений, стоящих перед разработчиками технологий захвата и хранения возобновляемой энергии в виде топлива для использования по запросу. Выработка электроэнергии из водорода сопоставима с аналогичной функциональностью платиновых катализаторов, но без их отравления, что обеспечивает высокую эффективность. В случае водородно-кислородных топливных элементов, продуктом которых является вода, выбросы парниковых газов отсутствуют.