Нетины: белки-направляющие аксонов и их роль в развитии нервной системы.

Введение

Класс белков, участвующих в навигации аксонов.

Нетрины – это класс белков, участвующих в навигации аксонов. Они названы в честь санскритского слова "нетр", что означает "проводник" или "направляющий". Нетрины генетически консервативны у нематод, дрозофил, лягушек, мышей и человека. По структуре нетрин напоминает внеклеточный матричный белок ламинин. Нетрины обладают хемотропностью: растущий аксон либо направляется к более высокой концентрации нетрина, либо от неё. Хотя детальный механизм навигации аксонов изучен не полностью, известно, что притяжение к нетрину опосредовано клеточными поверхностными рецепторами UNC 40/DCC, а отталкивание – рецепторами UNC 5. Нетрины также действуют как факторы роста, стимулируя пролиферацию и другие активности в клетках-мишенях. У мышей с дефицитом нетрина не формируется гиппокампальная комиссура или мозолистое тело. Предполагаемая модель активности нетринов в спинном столбе развивающихся человеческих эмбрионов заключается в том, что нетрины высвобождаются пластинкой основания спинного мозга и затем захватываются рецепторными белками, встроенными в ростовые конусы аксонов нейронов, развивающегося спинного столба. Тела этих нейронов остаются неподвижными, в то время как аксоны следуют по пути, определяемому нетринами, и в конечном итоге соединяются с нейронами внутри эмбрионального мозга, формируя синапсы. Исследования показывают, что новые аксоны, как правило, следуют ранее сформированным путям, а не направляются нетринами или другими хемотропными факторами.

Открытие

Нетрин был впервые описан в нематоде Caenorhabditis elegans в 1990 году и получил название UNC-6 в соответствии со стандартным протоколом номенклатуры C. elegans. Первый гомолог UNC-6 у млекопитающих был обнаружен в 1994 году, где было установлено, что он является важным сигналом для направления роста аксонов коммиссуры у грызунов в спинном мозге.

Обзор нетринов

Семейство нетринов состоит главным образом из секретируемых белков, которые выполняют роль двунаправленных сигналов: привлекая одни нейроны и отталкивая другие в процессе развития мозга. Экспрессируясь в средней линии всех животных, обладающих двусторонней симметрией, они могут действовать как сигналы как дальнего, так и ближнего действия во время нейрогенеза. Для реализации своих функций нетрины взаимодействуют со специфическими рецепторами: DCC или UNC5, в зависимости от того, стремятся ли они привлечь или оттолкнуть нейроны, соответственно. Вторичная структура нетринов характеризуется высокой степенью консервации и содержит несколько доменов, гомологичных ламинину на аминоконцевом участке. Наибольшая вариабельность между видами наблюдается в C-концевом домене, который содержит различные аминокислоты, обеспечивающие взаимодействие со специфическими белками во внеклеточном матриксе или на поверхности клеток. Различия в структуре и функциях привели к идентификации нескольких различных типов нетринов, включая нетрин-1, нетрин-3 и нетрины G.

Ключевые сетчатки

Нетрин 1 обнаруживается в клетках пластинки пола и нейроэпителиальных клетках вентральной области спинного мозга, а также в других участках нервной системы, включая соматическую мезодерму, поджелудочную железу и сердечную мышцу. Его основная роль заключается в аксональном наведении, миграции нейронов и морфогенезе различных ветвящихся структур. У мышей с мутациями в гене нетрина 1 наблюдалось отсутствие комиссуральных аксонов переднего мозга и спинного мозга. Нетрины 1 и 3 характеризуются эксклюзивной экспрессией в раковых клетках. Нетрин 3 отличается от других нетринов. В то время как он экспрессируется в ходе развития периферической нервной системы в мотонейронах, сенсорных и симпатических нейронах, его экспрессия в центральной нервной системе крайне ограничена. Аналогичная ранняя экспрессия и формирование градиента концентрации белка, исходящего от вентральной средней линии, наблюдаются в эпидермальных клетках развивающегося червя. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что этот градиент необходим для реализации функции UNC-6 на большом расстоянии при направлении начальной циркумференциальной миграции аксонов к вентральной средней линии, а рецептор UNC-40 опосредует аттрактивный ответ. По мере достижения дополнительных аксонов средней линии, временная и пространственная экспрессия UNC-6 становится все более ограниченной, что указывает на то, что после более общего дорсально-вентрального наведения аксонов, UNC-6 дополнительно участвует в направлении аксонов к более специфическим локализациям. Недавно ученые охарактеризовали многие клеточные механизмы, посредством которых связывание нетрина 1 с DCC стимулирует аксональное притяжение через как минимум три независимых сигнальных пути. Во всех трех путях нетрин 1 вызывает гомодимеризацию DCC, которая запускает каскад хемоаттракции. В первом пути фокальная адгезионная киназа (FAK) связывается с DCC, и оба подвергаются тирозиновому фосфорилированию при связывании с нетрином 1, что индуцирует рекрутинг и фосфорилирование Src и Fyn, что, как предполагается, приводит к увеличению концентрации вторичных мессенджеров Rac1 и Cdc42, тем самым способствуя удлинению конуса роста. Во втором возможном пути фосфатидилинозитоловый транспортный белок α (PITP) связывается с фосфорилированным DCC, который индуцирует фосфолипазу C (PLC) для увеличения соотношения cAMP к cGMP. Это увеличение cAMP по отношению к cGMP активирует кальциевые каналы L-типа, а также транзиторные рецепторные потенциальные каналы (TRPC), вызывая приток внеклеточного Ca2+. Данные свидетельствуют о том, что это увеличение концентрации кальция отвечает за активацию Rho GTPases, Cdc42, Rac1 и ядерного фактора транскрипции NFAT, которые могут инициировать удлинение конуса роста. Дополнительные исследования также показали, что нетрин-индуцированная передача сигналов между DCC и нисходящими мишенями NcK и белком синдрома Вискотта-Олдрича (WASP) активирует Rac1 и Cdc42 и, следовательно, аксональный рост.

Netrin 1 is found in the floor plate and neuroepithelial cells of the ventral region of the spinal cord, as well as other locations in the nervous system including the somatic mesoderm, pancreas and cardiac muscle. Its main role is in axonal guidance, neuronal migration and morphogenesis of different branching structures. Mice with mutations in the netrin 1 gene were observed to be lacking in forebrain and spinal cord commissural axons. Netrin 1 and 3 has been described to have an exclusive expression in cancer cells. Netrin 3 is different from other netrins. While expressed during development of the peripheral nervous system in the motor, sensory and sympathetic neurons, it is very limited in the central nervous system. The same early expression and formation of a protein concentration gradient emanating from the ventral midline is observed in epidermal cells of the developing worm. Evidence suggests that this gradient is essential for the long range function of UNC 6 in guiding the initial circumferential migration of axons to the ventral midline and that the UNC 40 receptor mediates the attractive response. As additional axons reach the midline, the temporal and spatial expression of UNC 6 becomes increasing restricted, indicating that after a more general dorsal ventral guidance of axons, UNC 6 is further involved in directing axons to more specific locations. Recently, scientists have characterized many of the cellular mechanisms by which netrin 1 binding to DCC motivates axonal attraction through at least three independent signaling pathways. In all three pathways netrin 1 is observed to cause the homodimerization of DCC that begins the chemoattraction cascade. In the first pathway, the focal adhesion kinase (FAK) is bound to DCC and both undergo tyrosine phosphorylation upon netrin 1 binding that induces the recruitment and phosphorylation of Src and Fyn, which is hypothesized to lead to an increase in second messengers Rac1 and Cdc42 thereby promoting growth cone extension. In a second possible pathway, phosphatidylinositol transfer protein α (PITP) binds to phosphorylated DCC which induces phospholipase C (PLC) to increase the ratio of cAMP to cGMP. This increase of cAMP relative to cGMP activates L type Ca2+ channels as well as transient receptor potential channels (TRPC's) causing an influx of extracellular Ca2+. Evidence suggests that this increased calcium is responsible for the activation of Rho GTPases, Cdc42 Rac1 and the nuclear transcription factor NFAT which can all initiate growth cone extension. Additional studies have also shown that netrin induced signaling between DCC downstream targets NcK, and Wiskott–Aldrich syndrome protein WASP trigger Rac1 and Cdc42 and subsequently axonal growth.

Отвращение

Как DCC у позвоночных, так и UNC 40 у C. elegans, как было показано, инициируют отталкивающий, а не привлекательный ответ при взаимодействии с нетриновым рецептором Unc5. В том же градиенте вентральной средней линии, о котором говорилось выше, нетрин 1 действует как хеморепеллент для аксонов трохлеарных двигательных нейронов, направляя их рост в дорсальном направлении (от вентральной средней линии). Ингибирование DCC антителами в спинном мозге эмбриона Xenopus подавляло как притяжение, так и отталкивание in vitro. Аналогично, у мутантов C. elegans unc 40 наблюдались множественные дефекты; однако, на паттерны миграции сильнее влияли мутации в гене unc 5, что указывает на то, что связывание гомолога нетрина 1, UNC 6, с рецептором UNC 5 само по себе способно отталкивать рост аксонов. Как в системах позвоночных, так и в системах беспозвоночных, хеморепульсия на коротких дистанциях, при высокой концентрации нетринов, по-видимому, осуществляется преимущественно через рецептор UNC 5, в то время как эффекты отталкивания на больших дистанциях при более диффузных концентрациях требуют координации между DCC (UNC 40 у C. elegans) и UNC 5. В настоящее время предполагается, что хеморепульсия на больших дистанциях включает инициирование пути арахидоновой кислоты при взаимодействии нетрина 1 с комплексом DCC/UNC 5. Этот путь повышает внутриклеточный уровень 12 HPETE (12-гидроперокси-5,8,10,14-эйкозатетраеновой кислоты), что индуцирует cGMP-сигналинг и, как следствие, снижает соотношение cAMP/cGMP. Снижение этого соотношения ингибирует кальциевую проводимость через кальциевые каналы L-типа (LCC) и в конечном итоге приводит к отталкиванию конуса роста посредством возможной активации RhoA (гомолога Ras, члена семейства A). Аналогичный механизм, опосредованный RhoA, предлагается и для хеморепульсии на коротких дистанциях, при котором связывание нетрина 1 исключительно с гомодимерами UNC 5 индуцирует тирозиновую фосфорилирование, требующее FAK и Src, что, в свою очередь, активирует RhoA. Дополнительный механизм предполагает, что связывание тирозинфосфатазы Shp2 с комплексом нетрина 1/UNC 5 также может вызывать хеморепульсию через RhoA.

Both DCC in vertebrates and UNC 40 in C. elegans have been shown to initiate a repulsive rather than attractive response when associated with the netrin receptor Unc5. In the same ventral midline gradient discussed above, netrin 1 acts as a chemorepellant for axons of the trochlear motor neurons, thus directing their growth dorsally (away from the ventral midline). Antibody inhibition of DCC in embryonic Xenopus spinal cord inhibited both attraction and repulsion in vitro. Likewise, multiple defects were observed in C. elegans unc 40 mutants; however, errors in migration patterns were more profoundly affected by mutations in the unc 5 gene, indicating that binding of the netrin 1 homologue UNC 6 to the UNC 5 receptor alone can repel axonal growth. In both vertebrate and invertebrate systems, short range chemorepulsion in which the concentration of netrins is high, seems to primarily occur via the UNC 5 receptor, while long range repulsive effects at more diffuse concentrations require coordination between DCC (UNC 40 in C. elegans) and UNC 5. It is currently hypothesized that long range chemorepulsion involves initiation of the Arachidonic acid pathway upon netrin 1 interaction with the DCC/UNC 5 complex. This pathway increases the intracellular levels of 12 HPETE (12 Hydroperoxy 5, 8, 10, 14 Eicosatetraenoic Acid), which induces cGMP signaling and subsequently causes a decrease in the cAMP/cGMP ratio. Reducing this ratio inhibits calcium conductance through the L type calcium channels (LCC) and ultimately results in growth cone repulsion though a possible activation of Ras homolog gene family, member A (RhoA). A similar RhoA mediated mechanism is proposed for short range chemorepulsion whereby netrin 1 binding to UNC 5 homodimers alone induces tyrosine phosphorylation requiring FAK and Src, which as a result activates RhoA. An additional mechanism proposes that binding of the tyrosine phosphatase Shp2 to the netrin 1/UNC 5 complex may also trigger chemorepulsion through RhoA.

Гидение глиа и мезодермы

Многие исследования показали, что нетрин 1, UNC 40, UNC 6 и UNC 5 участвуют в миграции глии в процессе эмбриогенеза. В ходе миграционной фазы у Drosophila melanogaster эмбриональная периферическая глиа (ePG) экспрессирует UNC 5. У организмов с нокаутом по гену UNC 5 ePG либо останавливаются в процессе миграции, либо не мигрируют вовсе.

Функции вне нейронной ориентации

Хотя изначально считалось, что нетрин специфически участвует в направленном росте аксонов в центральной нервной системе, новые исследования связали его с регуляцией рака, развитием и формированием не-нейральных тканей, а также с диагностикой рака и других заболеваний.

Развитие и регулирование тканей

Нетрин был обнаружен в ключевой роли в развитии и зрелой регуляции тканей вне нервной системы. К числу не-нейральных тканей, вовлеченных в этот процесс, относятся легкие, плацента, сосудистая система, поджелудочная железа, мышцы и ткань молочной железы. Нетрин способствует морфогенезу тканей, контролируя миграцию и адгезию клеток в различных органах. В развивающихся молочных железах растущие кончики протоковой сети состоят из двух слоев, образованных люминальными эпителиальными клетками и клетками крышечки. Люминальные клетки секретируют нетрин 1, который связывается с рецептором неогенином (гомологом DCC) на клетках крышечки. Это обеспечивает адгезию между двумя слоями клеток, необходимую для правильного морфогенеза терминальных концевых почек (ТЭБ) в молочных железах. Потеря гена, кодирующего нетрин 1 или неогенин, приводит к неправильному формированию ТЭБ, что позволяет предположить, что нетрин 1, в отличие от своей роли в качестве направляющей молекулы в нейронных системах, выполняет функцию адгезина в ткани молочной железы. Во время морфогенеза эмбрионального легкого эпителиальные клетки экспрессируют нетрин 1 и нетрин 4. Эти нетрины окружают эндодермальные почки в базальной мембране, предотвращая экспрессию DCC и UNC5B в клетках дистального конца. Это обеспечивает нормальное развитие легких и предотвращает потенциально опасное чрезмерное ветвление и образование бутонов. Нетрин был признан важной молекулой для пролиферации сосудистых сетей. Многочисленные исследования выявили различные эффекты нетрина на эти ветвящиеся сосуды. Эндотелиальные клетки-кончики в сосудистой ткани демонстрируют свойства, сходные со свойствами ростового конуса, обнаруженного в нейронной ткани. Исследования показали, что эти же эндотелиальные клетки-кончики также экспрессируют UNC5B, к которому может связываться нетрин 1, ингибируя ангиогенез. В то же время, ряд исследований показывают, что нетрин 1 фактически способствует ветвлению кровеносных сосудов. В связи с этим было установлено, что нетрин 4 отвечает за рост в лимфатической сосудистой системе. В целом, эти исследования показывают, что регуляторные эффекты нетрина зависят от типа сосудистой ткани. Недавно было показано, что нетрин участвует в ангиогенезе плаценты, что делает его жизненно важным для выживания плода. Это открытие имеет значение для будущего лечения сосудистых заболеваний плаценты. У взрослых нетрин участвует в регуляции движения стволовых клеток и воспаления. Было обнаружено, что нетрин 1 ингибирует миграцию лейкоцитов в очаги воспаления в организме. Это свидетельствует о том, что повышение регуляции нетрина защищает поврежденную ткань от избыточного воспаления. Кроме того, миграция взрослых нейронных прогениторных клеток и взрослых прогениторных клеток спинного мозга в спинной мозг зависит от нетрина 1. Механизмы, контролирующие ингибирование или притяжение этих стволовых клеток, изучены недостаточно.

Netrin has been discovered to play a key role in the development and mature regulation of tissue outside the nervous system. Some of the non neural tissues implicated include lung, placental, vasculature, pancreas, muscle and mammary gland tissue. Netrin contributes to tissue morphogenesis by controlling developing cell migration and cell adhesion in different organs. In developing mammary glands, the growing tips of the ductal network consist of two layers made up of luminal epithelial cells and cap cells. The luminal cells secrete netrin 1, which binds to the receptor neogenin (a homologue of DCC) on the cap cells. This allows for adhesion between the two cell layers, which is necessary for the proper morphogenesis of the terminal end buds (TEBs) in the mammary glands. Loss of the gene coding for either netrin 1 or neogenin leads to the improper formation of the (TEBs), suggesting that rather than acting as a guidance molecule as in neuronal systems, netrin 1 serves as an adhesive in mammary tissue. During the morphogenesis of the embryonic lung, epithelial cells express netrin 1 and netrin 4. These netrins surround endoderm buds in the basement membrane, preventing distal tip cells from expressing DCC and UNC5B. This allows for normal development of the lung and halts potentially dangerous over branching and budding from occurring. Netrin has been implicated as a vital molecule for the proliferation of vascular networks. Multiple studies have found different effects of netrin on these branching vessels. The endothelial tip cells in vascular tissue display similar properties to the growth cone found in neuronal tissue. Studies have discovered that these same endothelial tip cells also express UNC5B, which netrin 1 can bind to, inhibiting angiogenesis. In contrast, several studies show that netrin 1 actually promotes blood vessel branching. In conjunction with this research, it has been found that netrin 4 is responsible for growth in the lymphatic vascular system. Overall, these studies show that regulating effects of netrin is dependent on the type of vascular tissue. Recently, netrin has been implicated in angiogenesis in the placenta, making it vital to the survival of the fetus. This finding has implications in the future treatment of vascular disease in the placenta. In adults, netrin has been implicated in the regulation of stem cell movement and inflammation. Netrin 1 has been found to inhibit leukocyte migration to inflamed areas in the body. This provides evidence that the up regulation of netrin protects injured tissue from excess inflammation. Also, the migration of adult neural progenitor cell and adult spinal cord progenitor cells to the spine is netrin 1 dependent. Little is known of the mechanism controlling the inhibition or attraction of these stem cells.

Регулирование рака и маркеры заболевания

В различных типах рака у человека было показано, что нетрин сверхэкспрессируется. Также было установлено, что в этом процессе происходит подавление регуляции определенных рецепторов. Рецепторы нетрина DCC и UNC5H отвечают за регуляцию апоптоза. Отсутствие нетрина 1 вызывает апоптоз, в то время как присутствие нетрина 1 приводит к ингибированию апоптотического пути. Этот путь уникален и не зависит от митохондриального и рецепторного путей, приводящих к контролируемой гибели клеток. Это было наблюдалось в эпителии толстой кишки человека, где более высокий уровень естественной гибели клеток в верхней части ворсинок коррелировал с меньшим градиентом нетрина 1. Это связало роль нетрина со смертью тканей и ростом. Туморосупрессор p53 отвечает за экспрессию нетрина 1, что позволяет предположить, что нетрин может быть путем, посредством которого p53 регулирует клеточный цикл. Ввиду значительного влияния нетрина на регуляцию гибели клеток, ген, кодирующий нетрин (NTN1), считается онкогеном. Поскольку было обнаружено, что нетрин 1 сверхэкспрессируется в опухолях, недавние исследования были направлены на идентификацию нетрина 1 в качестве биомаркера для начала развития рака у человека. Было установлено, что нетрин обнаруживается в плазме крови пациентов с раком почек, печени, простаты, менингиомой головного мозга, аденомой гипофиза, глиобластомой и раком молочной железы на уровнях выше нормы. Нетрин 3 специфически экспрессируется в нейробластоме (детской опухоли) и в мелкоклеточном раке легких (МРЛ), где он коррелирует с неблагоприятным прогнозом для пациента.

Продолжение исследований нетрина

В отношении семейства молекул нетринов остаётся много нерешённых вопросов. До сих пор не установлено, какую роль играют гомологи UNC-5 у позвоночных в хеморепульсии. Хотя многое известно об экспрессии нетрина в процессе развития, мало что известно о его регуляции на более поздних стадиях развития мозга. Исследования на мышах с нокаутом по гену нетрина показывают, что предстоит многое узнать о многочисленных функциях нетрина в навигации аксонов. Важным направлением современных исследований является изучение нетрина как средства лечения различных заболеваний, включая рак, инфаркт миокарда и болезнь Альцгеймера. В моделях на птицах и мышах с нейробластомой вмешательство в автокриновую петлю нетрина-1 в злокачественных опухолях приводит к гибели клеток. Это может привести к разработке альтернативных методов терапии, которые будут протестированы в будущих клинических испытаниях. Аналогичные методы лечения, направленные на подавление экспрессии нетрина-1, также изучаются при метастатическом раке молочной железы и колоректальном раке. Недавние исследования также указывают на участие нетрина в кардиопротекторной функции, связанной с высвобождением оксида азота (NO). У мышей нетрин также ассоциируется с регуляцией пептида Aβ, который является причиной образования амилоидных бляшек при болезни Альцгеймера.