Введение

Род грибов, используемый в промышленности и в качестве модельного организма. Автоматический taxobox.
| name = Komagataella
| taxon = Komagataella
| image = Pichia pastoris GS115 (Yang 2017).jpg
| image caption = Komagataella phaffii. В 1995 году P. pastoris была отнесена к роду Komagataella как единственный его представитель, получив название Komagataella phaffii. Последующие исследования выявили и другие виды в этом роду, в результате чего на сегодняшний день признано 7 видов.

Природная среда обитания

В природе Komagataella встречается на деревьях, например, на каштанах. Это гетеротрофы, способные использовать различные источники углерода для существования, такие как глюкоза, глицерин и метанол. Однако лактозу они использовать не могут.

Размножение

Komagataella может размножаться как бесполым, так и половым путем, почкованием и посредством аскоспор. В этом случае существуют два типа клеток Komagataella: гаплоидные и диплоидные. В бесполом жизненном цикле гаплоидные клетки размножаются митозом. В половом жизненном цикле диплоидные клетки подвергаются спорообразованию и мейозу. Скорость роста её колоний может значительно варьироваться – от почти нулевой до времени удвоения в один час, что делает её пригодной для промышленных процессов.

Комагатаелла как образцовый организм

В последние несколько лет Komagataella была исследована и идентифицирована как перспективный модельный организм, обладающий рядом преимуществ. Прежде всего, Komagataella легко выращивать и использовать в лабораторных условиях. Как и другие широко используемые модельные дрожжи, она имеет относительно короткий жизненный цикл и быстрое время регенерации. Кроме того, были разработаны недорогие среды для культивирования, позволяющие Komagataella быстро расти на них, достигая высокой плотности клеток. Секвенирование всего генома Komagataella уже выполнено. Геном K. phaffii GS115 был секвенирован Фландрским институтом биотехнологии и Гентским университетом и опубликован в журнале Nature Biotechnology. Последовательность генома и аннотации генов доступны для просмотра в системе ORCAE. Полные геномные данные позволяют ученым идентифицировать гомологичные белки и изучать эволюционные связи между Komagataella и другими видами дрожжей. Более того, к 2022 году были секвенированы геномы всех семи видов. Еще одним преимуществом Komagataella является ее сходство с хорошо изученным модельным организмом – Saccharomyces cerevisiae. S. cerevisiae на протяжении десятилетий является важной моделью в биологических исследованиях и широко используется учеными для различных целей. Два рода дрожжей – Pichia (sensu lato) и Saccharomyces – имеют схожие условия роста и устойчивость к различным факторам; поэтому культивирование Komagataella может быть легко адаптировано в лабораториях без значительных изменений. Кроме того, в отличие от S. cerevisiae, Komagataella способна функционально обрабатывать белки с большой молекулярной массой, что делает ее полезной в качестве трансляционного хозяина. Учитывая все преимущества, Komagataella может быть эффективно использована как в генетических, так и в экспериментальных исследованиях.

Комагатаелла как генетический модельный организм

В качестве генетической модельной системы, Komagataella может быть использована для генетического анализа и масштабных генетических скрещиваний, благодаря полным данным о геноме и её способности осуществлять сложные эукариотические генетические процессы в относительно небольшом геноме. Функциональные гены, участвующие в сборке пероксисом, были исследованы путем сравнения дикого типа и мутантных штаммов Komagataella.

Комагатаелла как экспериментальный образцовый организм

В качестве экспериментального модельного организма Komagataella преимущественно использовалась как система-хозяин для трансформации. Благодаря способности к рекомбинации с чужеродной ДНК и процессингу крупных белков, было проведено множество исследований, направленных на изучение возможности производства новых белков и функций искусственно сконструированных белков с использованием Komagataella в качестве трансформационного хозяина. В последнее десятилетие Komagataella была модифицирована для создания платформ экспрессии, что является типичным применением для стандартного экспериментального модельного организма, как описано ниже.

Komagataella как платформа системы экспрессии

Комагатаэлла часто используется в качестве системы экспрессии для производства гетерологичных белков. Ряд свойств делают Komagataella подходящей для этой цели. В настоящее время для биотехнологических целей используется несколько штаммов Komagataella, между которыми существуют значительные различия в росте и продуктивности белков. Некоторые распространенные варианты несут мутацию в гене HIS4, что облегчает отбор клеток, успешно трансформированных векторами экспрессии. Технология интеграции векторов в геном Komagataella схожа с таковой для Saccharomyces cerevisiae.

Преимущество

Комагатаелла способна расти на простой и недорогой среде с высокой скоростью роста. Комагатаелла может культивироваться как в колбах с встряхиванием, так и в ферментере, что делает ее пригодной для производства как в малых, так и в больших масштабах. Комагатаелла обладает двумя генами алкогольной оксидазы, Aox1 и Aox2, которые содержат сильно индуцируемые промоторы. Эти два гена позволяют Комагатаелле использовать метанол в качестве источника углерода и энергии. Промоторы AOX индуцируются метанолом и репрессируются глюкозой. Как правило, ген, кодирующий целевой белок, вводят под контроль промотора Aox1, что позволяет индуцировать производство белка добавлением метанола в среду. После ряда исследований ученые установили, что промотор, производный от гена AOX1 в Комагатаелле, исключительно хорошо подходит для контроля экспрессии чужеродных генов, трансформированных в геном Комагатаеллы для производства гетерологичных белков. Важной особенностью Комагатаеллы является способность к росту при чрезвычайно высокой плотности клеток в культуре. Эта характеристика благоприятна для экспрессии гетерологичных белков, обеспечивая более высокую продуктивность. Технологии, необходимые для генетической модификации Комагатаеллы, аналогичны технологиям, используемым для Saccharomyces cerevisiae, одного из наиболее изученных модельных организмов среди дрожжей. Следовательно, экспериментальные протоколы и материалы для работы с Комагатаеллой легко разработать.

Недостатки

Поскольку для правильной сборки некоторым белкам требуется шаперонин, Komagataella не способна производить ряд белков, так как не содержит необходимых шаперонов. Технологии введения генов шаперонинов млекопитающих в геном дрожжей и сверхэкспрессии существующих шаперонинов всё ещё нуждаются в совершенствовании.

Сравнение с другими системами выражения

В стандартных исследованиях молекулярной биологии бактерия Escherichia coli является наиболее часто используемым организмом для систем экспрессии, для производства гетерологичных белков, благодаря быстрому темпу роста, высокой скорости синтеза белка и нетребовательным условиям культивирования. Производство белка в E. coli обычно происходит быстрее, чем в Komagataella, по следующим причинам: компетентные клетки E. coli можно хранить замороженными и размораживать перед использованием, в то время как клетки Komagataella необходимо готовить непосредственно перед использованием. Уровни экспрессии в Komagataella варьируются между разными клонами, поэтому для выявления наиболее продуктивного клона требуется скрининг большого числа клонов на предмет производства белка. Главное преимущество Komagataella перед E. coli заключается в способности Komagataella формировать дисульфидные связи и осуществлять гликозилирование белков, что невозможно для E. coli. E. coli может производить неправильно свернутый белок при наличии дисульфидных связей в конечном продукте, что приводит к образованию неактивных или нерастворимых форм белка. Хорошо изученный Saccharomyces cerevisiae также используется в качестве системы экспрессии, обладая схожими преимуществами перед E. coli, как и Komagataella. Однако Komagataella имеет два основных преимущества перед S. cerevisiae в лабораторных и промышленных условиях: Komagataella, как упоминалось выше, является метилотрофом, то есть способна расти на простом метаноле как единственном источнике энергии. Komagataella может быстро расти в клеточной суспензии с достаточно высокой концентрацией метанола, которая была бы смертельной для большинства других микроорганизмов. В этом случае система экспрессии отличается низкой стоимостью установки и обслуживания. Komagataella способна достигать очень высокой плотности клеток. В идеальных условиях она может размножаться до такой степени, что клеточная суспензия становится практически пастообразной. Поскольку выход белка из экспрессионной системы в микроорганизме приблизительно равен произведению количества белка, производимого на клетку, Komagataella особенно полезна при попытках получить большие количества белка без использования дорогостоящего оборудования. В 2006 году исследовательской группе удалось создать новый штамм под названием YSH597. Этот штамм способен экспрессировать эритропоэтин в его нормальной форме гликозилирования, путем замены ферментов, ответственных за грибковый тип гликозилирования, на гомологичные ферменты млекопитающих. Таким образом, модифицированная схема гликозилирования позволила белку стать полностью функциональным.

Производство ферментов

В пищевой промышленности, такой как пивоварение и хлебопечение, Komagataella используется для производства различных видов ферментов, выполняющих множество функций в качестве технологических вспомогательных веществ и пищевых добавок. Например, некоторые ферменты, производимые генетически модифицированной Komagataella, могут сохранять мягкость хлеба. В то же время, в пиве ферменты могут использоваться для снижения содержания алкоголя. Рекомбинантная фосфолипаза С способна удалять смолистые вещества из высокофосфорных масел, расщепляя фосфолипиды.