Механизмы контроля клеточного цикла эукариот

Введение

Контрольный механизм в евкариотическом клеточном цикле

Контрольные точки клеточного цикла – это механизмы контроля в евкариотическом клеточном цикле, обеспечивающие его правильное протекание. Каждая контрольная точка является потенциальной точкой остановки клеточного цикла, на которой оцениваются условия в клетке, и прохождение через различные фазы клеточного цикла происходит только при выполнении благоприятных условий. В клеточном цикле существует множество контрольных точек, но три основные: контрольная точка G1, также известная как точка старта, ограничения или главная контрольная точка; контрольная точка G2/M; и переход от метафазы к анафазе, также известная как контрольная точка веретена деления. Прохождение через эти контрольные точки в значительной степени определяется активацией циклинозависимых киназ регуляторными белковыми субъединицами, называемыми циклинами, различные формы которых производятся на каждой стадии клеточного цикла для контроля специфических событий, происходящих на этой стадии.

Предыстория

Все живые организмы являются продуктом многократных циклов клеточного роста и деления. В ходе этого процесса, известного как клеточный цикл, клетка дублирует свое содержимое, а затем делится на две. Цель клеточного цикла – точно удвоить ДНК каждого организма, а затем равномерно разделить клетку и ее содержимое между двумя образовавшимися клетками. У эукариотов клеточный цикл состоит из четырех основных стадий: G1, во время которой клетка метаболически активна и непрерывно растет; S-фаза, во время которой происходит репликация ДНК; G2, во время которой рост клетки продолжается и клетка синтезирует различные белки в подготовлении к делению; и M (митоз) фаза, во время которой дуплицированные хромосомы (известные как сестринские хроматиды) разделяются на два дочерних ядра, и клетка делится на две дочерние клетки, каждая с полной копией ДНК. По сравнению с эукариотическим клеточным циклом, прокариотический клеточный цикл (известный как бинарное деление) относительно прост и быстр: хромосома реплицируется от точки начала репликации, собирается новая мембрана, а клеточная стенка формирует перегородку, разделяющую клетку на две. Поскольку эукариотический клеточный цикл – сложный процесс, у эукариотов развилась сеть регуляторных белков, известная как система контроля клеточного цикла, которая контролирует и определяет продвижение клетки по клеточному циклу. Основным механизмом действия контрольных точек клеточного цикла является регуляция активности семейства белковых киназ, известных как циклинзависимые киназы (CDK), которые связываются с различными классами белков-регуляторов, известных как циклины, при этом специфические комплексы циклин-CDK формируются и активируются на различных фазах клеточного цикла. Эти комплексы, в свою очередь, активируют различные нижестоящие мишени, чтобы стимулировать или предотвращать прогрессирование клеточного цикла.

Контрольный пункт G1 (ограничение)

Контрольная точка G1, также известная как точка ограничения в клетках млекопитающих и точка старта в дрожжах, является точкой, в которой клетка необратимо входит в клеточный цикл. По мере прохождения клетки через G1, в зависимости от внутренних и внешних условий, она может задержаться в G1, перейти в состояние покоя, известное как G0, или преодолеть точку ограничения. В начале G1 существует три транскрипционных репрессора, известные как карманные белки, которые связываются с транскрипционными факторами E2F. Семейство генов E2F представляет собой группу факторов транскрипции, которые регулируют множество генов, важных для контроля клеточного цикла, включая циклины, CDK, регуляторы контрольных точек и белки, участвующие в репарации ДНК. Нарушение регуляции семейства E2F часто наблюдается при раке, что свидетельствует о его ключевой роли в строгом регулировании репликации и деления ДНК. Этот комплекс инактивирует Rb посредством фосфорилирования. Однако детали фосфорилирования Rb представляются довольно сложными и специфичными по сравнению с ранее известным о контрольной точке G1. ЦиклинD:Cdk4/6 присоединяет только одну фосфатную группу, то есть монофосфорилирует, Rb в одном из четырнадцати доступных и уникальных мест фосфорилирования. Каждая из четырнадцати специфических монофосфорилированных изоформ имеет различное сродство к связыванию с членами семейства E2F, что, вероятно, способствует разнообразию клеточных процессов в организме млекопитающих. Циклин E:Cdk2 продолжает фосфорилировать Rb во всех его участках фосфорилирования, также называемое гиперфосфорилированием, что обеспечивает полную инактивацию Rb. Гиперфосфорилирование Rb считается поздней точкой ограничения G1, после которой клетка не может вернуться в клеточном цикле. В этот момент белки E2F1 и E2F3 связываются с ДНК и транскрибируют гены циклинов А и Cdc6. В последнее время некоторые аспекты этой модели подвергаются сомнению.

Контрольный пункт G2

После репликации ДНК в S-фазе клетка переходит в фазу роста, известную как G2. В течение этого времени синтезируются необходимые митотические белки, и клетка вновь подвергается регуляторным механизмам для обеспечения надлежащего состояния перед входом в пролиферативную митотическую (M) фазу. В этом переходе от G2 к M участвуют множественные механистические контрольные точки, объединенные общим фактором – активностью циклин-зависимых киназ (Cdk). Хотя в разных организмах требуются различные комплексы циклин-Cdk, необходимость киназной активности сохраняется и обычно связана с одной парой. В дрожжах Schizosaccharomyces pombe существует три различные формы митотического циклина, а в Saccharomyces cerevisiae – шесть, однако основным используемым циклином является циклин B. Циклин B будет использоваться в качестве отправной точки для обсуждения перехода контрольной точки G2/M. Подобно S-фазе, G2 характеризуется контрольной точкой повреждения ДНК. Клетка повторно проверяется на наличие участков повреждения ДНК или незавершенной репликации, и киназы ATR и ATM рекрутируются к участкам повреждения. Также происходит активация Chk1 и Chk2, а также активация p53, что индуцирует остановку клеточного цикла и прекращает прогрессирование в митоз. Дополнительный компонент S-фазы, пререпликативный комплекс, должен быть инактивирован посредством фосфорилирования циклин B Cdk1. По мере оценки этих предыдущих контрольных точек, накопление белков G2 способствует активации активности циклин B Cdk1 посредством нескольких механизмов. Циклин A Cdk2 активирует Cdc25, активатор циклин B Cdk1, который, в свою очередь, деактивирует ингибитор циклин B Cdk1, Wee1. Это приводит к положительной обратной связи, значительно увеличивающей экспрессию циклина B и активацию Cdk1. По мере продвижения клетки через G2 и достижения перехода G2/M, киназа Plk1 фосфорилирует Wee1, что делает Wee1 мишенью для деградации посредством SCF-убиквитинлигазного комплекса. Дополнительная функция Plk1 – активировать Cdc25 посредством фосфорилирования. Совокупный эффект деградации Wee1 и активации Cdc25 заключается в чистом удалении ингибирующего фосфорилирования с cdc2, что активирует cdc2. Plk1 активируется в точке перехода G2/M Aurora A и Bora, которые накапливаются в течение G2 и образуют активационный комплекс. Комплекс Plk1-Cdc2-cdc25 затем инициирует положительную обратную связь, которая служит для дальнейшей активации Cdc2, и в сочетании с увеличением уровня циклина B в течение G2, полученные комплексы циклин B-cdc2 активируют нижестоящие мишени, способствующие вхождению в митоз. Полученная активность Cdk1 также активирует экспрессию Mem1-Fkh, гена перехода G2/M. Быстрый всплеск активности циклин B Cdk1 необходим, поскольку инициация M-фазы – это событие «все или ничего», включающее гистерезис. Гистерезис активности Cdk1 посредством циклина B запускает вход в M-фазу, устанавливая минимальный порог концентрации циклина B. Этот порог выше минимального уровня, необходимого для продолжения M-фазы после входа, что обеспечивает защиту события «все или ничего». Эта входная концентрация дополнительно увеличивается в случае неполной репликации ДНК, добавляя еще один регуляторный механизм в точке перехода G2/M. Наличие гистерезиса позволяет строго регулировать вход в M-фазу в зависимости от активности циклин B Cdk1. Механизмы, предотвращающие вход в митоз в ответ на повреждение ДНК, аналогичны тем, что действуют в контрольной точке G1/S. Повреждение ДНК запускает активацию вышеупомянутого пути ATM/ATR, в котором ATM/ATR фосфорилируют и активируют контрольные киназы Chk1/Chk2. Chk1/2 фосфорилируют cdc25, который, помимо ингибирования, также секвестрируется в цитоплазме белками 14-3-3. Белки 14-3-3 повышаются p53, который, как упоминалось ранее, активируется Chk1 и ATM/ATR. p53 также трансактивирует p21, и p21, а также белки 14-3-3, в свою очередь, ингибируют комплексы циклин B-cdc2 посредством фосфорилирования и цитоплазматического секвестрирования cdc2. Кроме того, инактивация cdc25 приводит к его неспособности дефосфорилировать и активировать cdc2. Наконец, другой механизм ответа на повреждение – отрицательная регуляция Plk1 посредством ATM/ATR, что, в свою очередь, приводит к стабилизации Wee1 и Myt1, которые затем могут фосфорилировать и ингибировать cdc2, тем самым удерживая клетку в G2 до устранения повреждения.

Following DNA replication in S phase, the cell undergoes a growth phase known as G2. During this time, necessary mitotic proteins are produced and the cell is once more subjected to regulatory mechanisms to ensure proper status for entry into the proliferative Mitotic (M) phase. Multiple mechanistic checkpoints are involved in this transition from G2 to M, with a common uniting factor of cyclin Cdk activity. Although variations in requisite cyclin Cdk complexes exist across organisms, the necessity of the kinase activity is conserved and typically focuses on a single pairing. In fission yeast three different forms of mitotic cyclin exist, and six in budding yeast, yet the primary cyclin utilized is cyclin B. Cyclin B will serve as reference for discussion of the G2/M checkpoint transition. Similar to S Phase, G2 experiences a DNA damage checkpoint. The cell is once more examined for sites of DNA damage or incomplete replication, and the kinases ATR and ATM are recruited to damage sites. Activation of Chk1 and Chk2 also transpire, as well as p53 activation, to induce cell cycle arrest and halt progression into mitosis. An additional component of S phase, the Pre Replicative Complex, must be inactivated via cyclin B Cdk1 phosphorylation. As these previous checkpoints are assessed, G2 protein accumulation serves to activate cyclin B Cdk1 activity via multiple mechanisms. CyclinA Cdk2 activates Cdc25, an activator of cyclin B Cdk1, which then deactivates the cyclin B Cdk1 inhibitor, Wee1. This results in a positive feedback loop, significantly increasing cyclin B expression and Cdk1 activation. As the cell progresses through G2 and reaches the G2/M transition, the kinase Plk1 phosphorylates Wee1, which targets Wee1 for degradation via the SCF ubiquitin ligase complex. An additional function of Plk1 is to activate Cdc25 through phosphorylation. The compound effect of Wee1 degradation and Cdc25 activation is the net removal of inhibitory phosphorylation from cdc2, which activates cdc2. Plk1 is activated at the G2/M transition by the Aurora A and Bora, which accumulate during G2 and form an activation complex. The Plk1 Cdc2 cdc25 complex then initiates a positive feedback loop which serves to further activate Cdc2, and in conjunction with an increase in cyclin B levels during G2, the resulting cdc2 cyclin B complexes then activate downstream targets which promote entry into mitosis. The resultant Cdk1 activity also activates expression of Mem1 Fkh, a G2/M transition gene. The rapid surge in cyclin B Cdk1 activity is necessary, as M phase initiation is an all or nothing event engaging in hysteresis. Hysteresis of Cdk1 activity via cyclin B drives M phase entry by establishing a minimum threshold of cyclin B concentration. This exists at a level higher than the minimum needed for the continuation of M phase after entry, acting to safeguard the all or nothing event. This entry concentration is further increased in the case of incomplete DNA replication, adding another regulatory mechanism at the G2/M transition point. The presence of hysteresis allows for M phase entry to be highly regulated as a function of cyclin B Cdk1 activity. The mechanisms by which mitotic entry is prevented in response to DNA damage are similar to those in the G1/S checkpoint. DNA damage triggers the activation of the aforementioned ATM/ATR pathway, in which ATM/ATR phosphorylate and activate the Chk1/Chk2 checkpoint kinases. Chk1/2 phosphorylate cdc25 which, in addition to being inhibited, is also sequestered in the cytoplasm by the 14 3 3 proteins. 14 3 3 are upregulated by p53, which, as previously mentioned, is activated by Chk1 and ATM/ATR. p53 also transactivates p21, and both p21 and the 14 3 3 in turn inhibit cyclin B cdc2 complexes through the phosphorylation and cytoplasmic sequestering of cdc2. In addition, the inactivation of cdc25 results in its inability to dephosphorylate and activate cdc2. Finally, another mechanism of damage response is through the negative regulation of Plk1 by ATM/ATR, which in turn results in the stabilization of Wee1 and Myt1, which can then phosphorylate and inhibit cdc2, thus keeping the cell arrested in G2 until the damage is fixed.

Переход G2M в ооцитах Xenopus

В конце фазы G2 клетка переходит в митоз, где происходит деление ядра. Переход от G2 к M фазе является резким; наблюдается эффект "все или ничего", и этот переход необратим. Это выгодно для клетки, поскольку вход в митоз – критически важный этап в жизненном цикле клетки. Если клетка не завершит этот переход полностью, она столкнется с множеством проблем, связанных с частичным делением, что, скорее всего, приведет к ее гибели. В яйцеклетках лягушек каскад сигналов запускается при связывании прогестерона с мембранным рецептором. Далее активируется Mos. Mos, в свою очередь, фосфорилирует MEK1, который фосфорилирует MAPK. MAPK выполняет две функции: активирует комплекс Cyclin B Cdk1, инициируя вход в митоз, и активирует Mos. Активация Mos приводит к образованию петли положительной обратной связи и, следовательно, действует как "переключатель", обеспечивая резкий и необратимый вход в митоз. Эта петля обратной связи была впервые обнаружена, когда было показано, что концентрация фосфорилированного MAPK (MAPK P) возрастает в ответ на повышение уровня прогестерона. На уровне отдельных клеток каждая клетка либо полностью фосфорилировала MAPK, либо не содержала фосфорилированного MAPK, что подтверждает его работу как переключательного механизма в каждой клетке. Дополнительно было показано, что блокирование синтеза белка Mos делает ответ MAPK P более плавным, что указывает на необходимость синтеза белка Mos для обеспечения эффекта "все или ничего" при активации MAPK.

Бистабильность

Этот процесс можно понять, рассматривая нестабильность. Используя график справа, видно, как скорость синтеза Mos меняется при добавлении прогестерона. Для каждой кривой существуют стабильные и нестабильные точки равновесия. В нестабильных точках равновесия система стремится к одной из стабильных точек. Таким образом, система может находиться либо в состоянии "включено", либо в состоянии "выключено", но не в промежуточном состоянии. Когда уровень прогестерона достаточно высок, кривая Mos смещается вверх и в конечном итоге пересекает линию деградации только в одной точке, что соответствует единственной стабильной точке "включено" и указывает на начало митоза. Необратимость, наблюдаемая в точке перехода в митоз, обусловлена достаточно высоким уровнем прогестерона в клетке. При достаточно высоких уровнях прогестерона система становится моностабильной из-за положительной обратной связи между Mapk и Mos. Точка, в которой система переходит от бистабильности к моностабильности, называется бифуркацией седлового узла. Таким образом, необратимый и однозначный ответ митотического перехода можно объяснить математической моделью молекулярных регуляторов как бистабильной системы, зависящей от наличия положительной обратной связи. Состояние "выключено" устраняется достаточно высоким уровнем прогестерона, и как только клетка преодолевает это состояние, она фиксируется в состоянии "включено".

Гистерезис и модель Новака Тайсона

Исходя из этой бистабильной модели, мы можем понимать митотический переход как зависящий от гистерезиса для его осуществления. Гистерезис определяется как зависимость состояния системы от её предшествующей истории. Модель Новака – Тайсона – это математическая модель прогрессирования клеточного цикла, которая предсказывает, что необратимые переходы при входе и выходе из митоза обусловлены гистерезисом. Модель делает три основных предсказания, которые должны выполняться в циклических экстрактах ооцитов, прогрессирование клеточного цикла которых зависит от гистерезиса:

Концентрация циклина B, необходимая для входа в митоз, выше, чем концентрация, необходимая для поддержания митотического экстракта в митозе. Нереплицированная ДНК повышает уровень циклина, необходимый для активации Cdc2 и, следовательно, для входа в митоз. Наблюдается снижение скорости активации Cdc2 при концентрациях циклина B, лишь немного превышающих порог активации. Ша и соавторы в 2003 году провели эксперименты с экстрактами яиц Xenopus laevis, чтобы продемонстрировать эту гистерезисную природу. Используя циклические экстракты, они обнаружили, что порог активации для Δциклина B находится в диапазоне от 32 до 42 нМ, в то время как порог инактивации – от 16 до 24 нМ Δциклина B. Таким образом, эти эксперименты подтвердили бистабильность этой системы и важность гистерезиса в этом переходе клеточного цикла. При промежуточных концентрациях циклина B возможны как интерфазное, так и митотическое состояние клетки.

Реакция на стресс репликации

Поскольку вступление в митоз – это значительное и затратное обязательство для клетки, логично, что существуют системы, предотвращающие преждевременный вход в эту стадию. Показано, что ошибки на предыдущих этапах, такие как наличие нереплицированных участков ДНК, блокируют продвижение в клеточном цикле. Модель Новака–Тайсона предсказывает, что это происходит путем повышения уровня циклина B, необходимого для начала митоза. Последний является белком, функция которого – ингибировать сепаразу, которая, в свою очередь, расщепляет когезины, белковый комплекс, отвечающий за скрепление сестринских хроматид. После деградации этого ингибирующего белка посредством убиквитинирования и последующего протеолиза, сепараза вызывает разделение сестринских хроматид. После разделения клетки на две дочерние клетки, клетка переходит в фазу G1.

Рак

Процессы репарации ДНК и контрольные точки клеточного цикла тесно связаны с раком благодаря своим функциям, регулирующим стабильность генома и прогрессию клеток, соответственно. Точные молекулярные механизмы, связывающие нарушения в этих путях с развитием конкретных видов рака, в большинстве случаев остаются неясными. Показано, что потеря ATM предшествует развитию лимфомы, вероятно, из-за избыточной гомологической рекомбинации, приводящей к высокой геномной нестабильности. Нарушение функции Chk1 у мышей привело к значительной дерегуляции контрольных точек клеточного цикла, накоплению повреждений ДНК и увеличению заболеваемости опухолями. Наследование мутантной копии гена BRCA1 или BRCA2 предрасполагает женщин к раку молочной железы и яичников. Известно, что BRCA1 необходим для переходов S-фазы и G2/M-фазы и участвует в клеточном ответе на повреждение ДНК. Считается, что BRCA2 участвует в гомологической рекомбинации и регуляции контрольной точки S-фазы, а мутации или дефициты BRCA2 тесно связаны с развитием опухолей.