Терализумаб: от клинических неудач к новым исследованиям рака и артрита

Введение

Моноклональное антитело

Терализумаб (также известный как TGN1412, CD28 SuperMAB и TAB08) — это иммуномодулирующий препарат, разработанный Томасом Хюнигом из Университета Вюрцбурга. Разработка препарата была прекращена после того, как в первом исследовании на людях, проведенном компанией Parexel в Лондоне в марте 2006 года, он вызвал тяжелые воспалительные реакции и хроническую органную недостаточность. Разрабатывающая компания TeGenero Immuno Therapeutics обанкротилась позднее в том же году. Коммерческие права затем были приобретены российским стартапом TheraMAB. Препарат был переименован в TAB08. Клинические испытания фазы I и II для лечения артрита завершены, а клинические испытания для лечения рака начаты. Изначально предназначенный для лечения хронического лимфоцитарного лейкоза (ХЛЛ) и ревматоидного артрита, TGN1412 представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, которое не только связывается с CD28-рецептором Т-клеток иммунной системы, но и является его сильным агонистом. CD28 является сорецептором Т-клеточного рецептора; он связывается с рецепторами взаимодействующего партнера в реакции посредством одного из своих лигандов (семейства B7). Препарат, который Европейское агентство лекарственных средств признало лекарственным средством-сиротой в марте 2005 года, был разработан компанией TeGenero Immuno Therapeutics, протестирован компанией Parexel и произведен компанией Boehringer Ingelheim. TeGenero объявила о первом определении молекулярной структуры CD28 почти ровно за год до начала клинического исследования фазы I препарата TGN1412.

Производство

Мышей инбридного штамма BALB/c иммунизировали рекомбинантными человеческими CD28 Fc-фьюзионными белками и усилили иммунный ответ линией клеток B-лимфомы, трансфицированной для экспрессии человеческого CD28. Гибридомы были получены путем слияния B-клеток с гибридомным партнером X63Ag8.653 и отобраны по реактивности с человеческим CD28 и митогенной активности, не зависящей от TCR. Были идентифицированы два моноклональных антитела: 5.11A1 и 9D7. Наиболее активным из них, 5.11A1, является мышиный иммуноглобулин IgG1. Определяющие комплементарность регионы (CDR) 5.11A1 были клонированы в каркас человеческого IgG и объединены с постоянными регионами IgG1 (TGN1112) или IgG4 (TGN1412). Согласно информации, представленной в брошюре исследователя, "TGN1412 – это гуманизированное моноклональное антитело, направленное против человеческого антигена CD28. Молекула была генетически сконструирована путем переноса CDR из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей моноклонального мышиного антитела к человеческому CD28 (5.11A1, Luhder et al., 2003) в вариабельные каркасы тяжелой и легкой цепей человека. Гуманизированные вариабельные области были впоследствии рекомбинированы с человеческим геном, кодирующим гамма-цепь IgG4, и с человеческим геном, кодирующим каппа-цепь человека, соответственно". Рекомбинантные гены были трансфицированы в клетки яичников китайского хомяка, а рекомбинантное антитело было выделено из культуральной жидкости.

Механизм действия

Активация Т-клеток обычно требует как взаимодействия с рецептором антигена (сигнал 1), так и костимуляции (сигнал 2). Исследования моноклональных антител, специфичных к CD28 мыши, крысы или человека, выявили так называемые "суперагонистические" антитела, способные стимулировать Т-клетки без одновременной стимуляции рецептора антигена (сигнал 1). Неясно, представляет ли эта активность большую силу или иной механизм действия. Были идентифицированы два антитела, специфичных к человеческому CD28. Более активное из них, TGN1112 (первоначально названное 5.11A1), относится к классу иммуноглобулинов IgG1. Другое, TGN1412 (клон 9D7), относится к классу IgG4. Независимый от TCR агонизм этих антител обусловлен связыванием с определенной частью молекулы CD28, называемой петлей C"D. Изначально предполагалось, что антитело с такими свойствами может быть терапевтически полезным для стимуляции иммунной системы у пациентов с иммунодефицитом. Однако данные, полученные в исследованиях на животных in vitro и in vivo, впоследствии показали, что введение препарата приведет к преимущественной активации регуляторных Т-клеток, что в конечном итоге приведет к подавлению активности Т-клеток. На своем веб-сайте компания заявила: "Выраженная активация и расширение Т-клеток, опосредованные CD28 SuperMAB в моделях на животных, сопровождаются экспрессией противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10, а не тяжелым цитокиновым штормом провоспалительных медиаторов, индуцированным другими препаратами, воздействующими на комплекс TCR". Другими клетками, активируемыми лигацией CD28 у человека, являются эозинофильные гранулоциты. Они могут высвобождать IFN-γ, IL-2, IL-4 и IL-13. Однако большинство экспериментов in vitro ограничены использованием очищенных мононуклеарных клеток периферической крови (ПМБК), которые не содержат эти клетки. Предполагается, что для функционирования в качестве агониста TGN1412 необходимо представлять собой цельную молекулу антитела, включая константную (Fc) область. Согласно отчету TeGenero, фрагмент F(ab)2 не способен генерировать необходимую стимуляцию. В отличие от родственного клона TGN1112, IgG1, TGN1412 относится к подклассу IgG4. Этот выбор был сделан, поскольку TGN1112 проявлял антителозависимую клеточную цитотоксичность в отношении CD28+ клеток Jurkat. Таким образом, связывание антител через Fcγ-рецептор, по-видимому, является необходимым условием для иммунной регуляции. Однако опсонизация клеток антителами обычно приводит к фагоцитозу меченых клеток, как это наблюдается при ВИЧ-инфекции.

Activation of T cells normally requires both engagement of the antigen receptor (signal 1) and co stimulation (signal 2). Studies of monoclonal antibodies specific for mouse, rat, or human CD28 identified so called "superagonistic" antibodies that could stimulate T cells without concurrent antigen receptor stimulation (signal 1). Whether this activity represents a stronger activity or a different activity is uncertain. Two antibodies specific for human CD28 were identified. The more active of the two, TGN1112 (originally called 5.11A1), belonged to the IgG1 class of immunoglobulins. The other, TGN1412 (clone 9D7), belonged to the IgG4 class. The TCR independent agonism of these antibodies involved binding to a specific part of the CD28 molecule called the C"D loop. It was initially hypothesized that an antibody with this property could be therapeutically useful in stimulating the immune system in immunosuppressed patients. However, in vitro and in vivo data from animal studies later suggested that administration would lead to preferential activation of regulatory T cells, leading to a net effect of T cell downregulation. On its website, the company wrote: "A pronounced T cell activation and expansion mediated by CD28 SuperMAB in animal models is accompanied by the expression of anti inflammatory cytokines, like IL 10, rather than by the severe cytokine release syndrome of pro inflammatory mediators induced by other agents that address the TCR complex.". Other cells activated by CD28 ligation in humans are eosinophil granulocytes. They can release IFN γ, IL 2, IL 4, and IL 13. However, most in vitro experiments are limited to the use of purified peripheral blood mononuclear cells (PBMN's) that do not contain those cells. To function as an agonist, it has been suggested that TGN1412 needs to be a whole antibody, including the constant (Fc) region. According to a report by TeGenero, the F(ab)2 is not able to generate the required stimulation. Unlike the related clone TGN1112, an IgG1, TGN1412 is of the subclass IgG4. This choice was made as TGN1112 showed antibody dependent cellular cytotoxicity on CD28+ Jurkat cells. Thus the function of antibody binding via an Fcγ receptor seems to be a requirement for the immune regulation. However, cell opsonisation by antibody leads normally to phagocytosis of the labeled cells, as seen in the case of HIV.

История

В первых клинических испытаниях на людях препарат вызвал катастрофическую системную недостаточность органов у испытуемых, несмотря на то, что он был введен в предполагаемой субклинической дозе 0,1 мг на кг, примерно в 500 раз ниже дозы, признанной безопасной для животных. Шесть добровольцев были госпитализированы 13 марта 2006 года. У по крайней мере четырех из них развилась множественная органная дисфункция. Клинические испытания фазы I проводились компанией Parexel в независимом подразделении клинических исследований, расположенном в арендованном помещении на территории больниц Northwick Park и St. Mark's Hospital в Лондоне 13 марта 2006 года. Parexel – компания, проводящая клинические испытания лекарственных средств от имени фармацевтических и биотехнологических компаний. Для участия в исследовании были набраны здоровые добровольцы, которым выплачивалось вознаграждение в размере 2000 фунтов стерлингов. В результате испытания все шесть добровольцев, которым вводили препарат, были госпитализированы, у по крайней мере четырех из них развилась множественная органная дисфункция. Исследование было двойным слепым, рандомизированным и плацебо-контролируемым: из восьми испытуемых двое получали плацебо, а шестеро – 1/500 от максимальной дозы, использованной в предыдущих экспериментах на макаках-циномольгусах. Все шесть испытуемых, получивших препарат, были мужчинами в возрасте от 19 до 34 лет (медиана 29,5 лет); ни у кого не было значительных заболеваний в анамнезе, и все чувствовали себя хорошо за две недели до начала испытания. У всех мужчин был зафиксирован тяжелый синдром высвобождения цитокинов, приведший к развитию ангиоэдемы, отеку кожи и слизистых оболочек, напоминающему эффекты каскада комплемента при тяжелой аллергической реакции. Пациентам назначали кортикостероиды для уменьшения воспаления и плазмаферез с целью удаления TGN1412 из кровообращения. Парадоксально, но некоторые виды лейкоцитов мужчин (лимфоциты и моноциты, участвующие в иммунных ответах) практически полностью исчезли спустя несколько часов после введения TGN1412. Согласно пресс-релизу от 5 июля 2006 года, опубликованному Северо-Западным трастом больниц NHS, где проходило лечение мужчин, состояние пациентов продолжало улучшаться, и «пять из них выписались из больницы в течение месяца после инцидента, а один пациент оставался в стационаре до 26 июня, после чего также был выписан». Ранее TGN1412 не применялся к людям, однако исследованию предшествовали доклинические испытания на животных, в том числе на приматах. Компания утверждает, что эти испытания не выявили каких-либо проблем с безопасностью, что было подтверждено последующими отчетами MHRA. TeGenero вскоре после произошедшего принесла извинения семьям пострадавших, подчеркнув, что наблюдаемые эффекты были совершенно неожиданными и что все протоколы были соблюдены. В ходе первоначального анализа доклинических данных и протокола MHRA заявила об отсутствии оснований для беспокойства и подтвердила, что испытание было проведено в соответствии с установленными правилами. Участники, пострадавшие в ходе испытаний препарата, впоследствии получили дополнительную финансовую компенсацию, которую один из участников использовал для найма персонального тренера с целью восстановления физической формы.

In its first human clinical trials, it caused catastrophic systemic organ failures in the subjects, despite being administered at a supposed sub clinical dose of 0.1 mg per kg, some 500 times lower than the dose found safe in animals. Six volunteers were hospitalized on 13 March 2006. At least four of them had multiple organ dysfunction. The Phase I clinical trials were conducted by Parexel at an independent clinical trials unit in leased space on the premises of Northwick Park and St. Mark's Hospital, London, on 13 March 2006. Parexel is a company that carries out drug trials on behalf of pharmaceutical and biotechnology companies. Healthy volunteers were recruited to the study with a £2,000 fee. The trial resulted in hospitalization of all six volunteers administered the drug, at least four of whom had multiple organ dysfunction. The trial was a double blind, randomized, placebo controlled study, with two of the eight subjects receiving a placebo, and six receiving 1/500th of the highest dose used in previous experiments with cynomolgus macaques. All six of the trial subjects who received the drug were male, aged 19 to 34 (median 29.5); none had a notable medical history, and all were well in the 2 weeks before the trial. All of the men were reported to have experienced severe cytokine release syndrome resulting in angioedema, swelling of skin and mucous membranes, akin to the effects of the complement cascade in severe allergic reaction. The patients were treated with corticosteroids to reduce inflammation, and plasma exchange to attempt to remove TGN1412 from their circulation. Paradoxically, some kinds of the men's white blood cells (lymphocytes and monocytes, involved in immune responses) had vanished almost completely several hours after administration of TGN1412. According to a press release on 5 July 2006 from North West London Hospitals NHS Trust, where the men were treated, the patients continued to improve and "five of them went home within a month of the incident, while one patient remained in hospital until 26 June, when he also went home". TGN1412 had not previously been given to humans, however the trial was preceded by animal testing, including in non human primates. The company claims that these did not indicate any safety issues, and this was supported in subsequent MHRA reports. TeGenero apologised to the families involved soon after the events, insisting that the effects were completely unexpected, and that all protocols were followed. In an initial review of pre clinical data and the protocol, the MHRA stated there was nothing to cause concern, and that the trial was correctly authorised. Participants who were harmed in the drug trial received some additional financial compensation later, which one participant used to hire a personal trainer so he could regain physical fitness.

Расследования

5 апреля 2006 года Агентство по регулированию лекарственных средств и медицинских изделий (MHRA) опубликовало промежуточный отчет об исследовании TGN1412, а 25 мая 2006 года – окончательный отчет. В отчете не было выявлено недостатков в доклинических исследованиях, проведенных TeGenero, и не обнаружено свидетельств утаивания каких-либо исследований. Документация и процессы, связанные с Parexel, включая измерение и введение дозы, были признаны надлежащими, и не было выявлено недостатков, которые могли бы привести к загрязнению или передозировке. MHRA посчитало, что их действия не способствовали возникновению серьезных нежелательных явлений. Немецкие регулирующие органы провели инспекцию производства материала компанией Boehringer Ingelheim, изучив процессы производства, контроля качества, хранения и дистрибуции TGN1412, но не выявили недостатков, которые могли бы способствовать развитию серьезных неблагоприятных эффектов. MHRA пришло к выводу, что наиболее вероятной причиной реакции у испытуемых было непредсказуемое биологическое действие препарата на организм человека. Министр здравоохранения Великобритании согласился сформировать группу ведущих международных экспертов для рассмотрения этих вопросов и подготовки отчета о будущем разрешении проведения подобных испытаний, с предоставлением промежуточного отчета через три месяца. Председателем группы был назначен Гордон Дафф, профессор молекулярной медицины Шеффилдского университета. До публикации отчета экспертной группы, приостанавливалось одобрение любых заявок на проведение клинических испытаний первой фазы, включающих испытания на людях моноклональных антител или других новых молекул, воздействующих на иммунную систему. В декабре 2006 года был опубликован окончательный отчет экспертной группы по клиническим испытаниям первой фазы. В отчете было установлено, что в ходе исследования не рассматривался вопрос об определении безопасной дозы для человека, и действующее законодательство того времени не требовало этого. Было дано 22 рекомендации, включая необходимость получения независимой экспертной оценки перед началом исследования с высоким риском, тестирование только одного добровольца за раз (последовательное включение участников) в случае быстрого развития нежелательных эффектов, а также медленное введение препарата путем инфузии, а не инъекции.

The Medicines and Healthcare products Regulatory Agency (MHRA) issued an interim report on the TGN1412 trial on 5 April 2006, followed by a final report on 25 May 2006. It found no deficiencies in TeGenero's pre clinical work and no evidence of undisclosed studies. Parexel's records and processes appeared in order, including dose measurement and administration, and no deficiencies were found that may have led to contamination or overdose. The MHRA felt that their actions did not contribute to the serious adverse events. German regulatory authorities inspected the production of the material by Boehringer Ingelheim, looking at the manufacture, testing, storage and distribution of the TGN1412, but no deficiencies were identified which could have contributed to the serious adverse effects. The MHRA concluded that the most likely cause of the reaction in trial subjects was an unpredicted biological action of the drug in humans. The UK Secretary of State for Health agreed to establish a group of leading international experts to consider those issues and to provide a report on the future authorization of such trials with an interim report at three months, with Gordon Duff, Professor of Molecular Medicine at Sheffield University, as Chair of the group. Until the expert group reported, all further clinical trial applications involving first in humans trials of any monoclonal antibody or other novel molecules targeting the immune system were not to be authorised in the UK. In December 2006, the final report of the Expert Group on Phase One Clinical Trials was published. It found that the trial had not considered what constituted a safe dose in humans, and that then current law had not required it. It made 22 recommendations, including the need for independent expert advice before a high risk study was allowed, testing only one volunteer at a time (sequential inclusion of participants) in case there were rapid ill effects, and administering drugs slowly by infusion rather than as an injection.

Последующие публикации

Этот процесс стал предметом нескольких научных публикаций. В 2007 году иммунологи из Института Пола Эрлиха, Федерального агентства по сывороткам и вакцинам Германии, рассмотрели нормативные требования Германии после испытания TGN1412. Они предположили, что прогностическая ценность доклинических моделей на животных требует переоценки, определение дозировки нуждается в уточнении или пересмотре, и необходимо установить критерии для антител высокого риска. Кроме того, они предложили, что перед исследованиями фазы I необходимы исследования для расчета дозы, основанной на доклиническом уровне "отсутствия эффекта", а не на уровне "отсутствия наблюдаемых побочных эффектов". В начале 2007 года ученые выдвинули теорию о том, что препарат действует иначе на людей, чем на лабораторных животных, на которых он впервые был испытан. Они полагают, что тяжелые реакции у людей могли возникнуть только у тех, у кого есть Т-лимфоциты памяти. Животные, выращенные в стерильных условиях, предположительно, не имеют "памяти" о перенесенных ранее заболеваниях и, следовательно, не проявляют тех тяжелых реакций, которые наблюдались у людей. Однако это является неверным истолкованием исследования: в нем говорится, что у лабораторных животных, участвующих в исследовании, меньше Т-клеток памяти, чем у людей, и что стимуляция через рецептор CD28 в Т-клетках памяти вызывает их инфильтрацию в органы и их активацию. Экспериментальные исследования in vitro и моделирование, опубликованные в 2008 году, показали, что начальная доза 0,1 мг связывается с 86–91% всех CD28-рецепторов в организме, что может привести к более выраженному эффекту, чем ожидалось, даже при очень низких начальных дозах. В 2009 году Национальный институт биологических стандартов и контроля Великобритании отметил, что была применена почти максимальная иммуностимулирующая доза, поскольку безопасная начальная доза для человека была рассчитана "на основе результатов доклинических исследований безопасности на нечувствительном виде" (Macaca fascicularis). В отчете также указывалось, что были пересмотрены европейские руководящие принципы для первых клинических испытаний биологических препаратов на людях. В 2010 году было объяснено, почему не удалось предсказать развитие тяжелого синдрома высвобождения цитокинов у людей. Данные, полученные in vitro, показали, что эффекторные CD4+ Т-клетки памяти Macaca fascicularis, вида приматов, используемых для доклинических исследований безопасности TGN1412, не экспрессируют CD28. Поскольку CD28 является мишенью антитела TGN1412, эффекторные Т-клетки M. fascicularis не могут быть стимулированы препаратом. В 2013 году было описано, что стандартные провоспалительные маркеры TNFα и IL-8 не позволяют предсказать необычную провоспалительную реакцию на TGN1412 и дают ложноотрицательные результаты. Выделение IL-2 и лимфопролиферация являются более надежными предикторами ответа. В 2016 году исследование, проведенное на гуманизированных мышах, оценило влияние TGN1412 на иммунную систему и подтвердило, что он может вызывать синдром высвобождения цитокинов, разрушение лейкоцитов и другие негативные эффекты, наблюдавшиеся во время первоначального испытания на людях.

The trial has become subject of several academic publications. In 2007, immunologists from the Paul Ehrlich Institute, the German Federal Agency for Sera and Vaccines, reviewed Germany's regulatory requirements in the aftermath of the TGN1412 trial. They suggested that the predictive value of pre clinical animal models required reevaluation, dose fixing needed refinement or redesign, and criteria for high risk antibodies needed to be established. Additionally, they suggested that pre Phase I studies were needed to calculate a dose with a pre clinical "No effect" level, rather than a No observed adverse effect level. Scientists in early 2007 put forth the theory that the drug acted in a different fashion in humans as compared with the laboratory animals in which the drug was first tried. The severe reactions in humans could have only occurred, they believe, in those with memory T lymphocytes. Animals raised in a sterile lab would presumably have no 'memory' of previous illnesses, thus would not exhibit the severe reactions that occurred in the human subjects. However this is a misunderstanding of the research: the research says that lab animals studied have fewer memory T cells than humans, and that stimulation through the CD28 receptor alone in memory T cells causes them to infiltrate organs and also activates them. Experimental in vitro research and modelling, published in 2008, suggested that the 0.1 mg starting dose would bind to 86 to 91% of all CD28 receptors in the body, resulting in a possible higher than expected effect even at very low starting doses. In 2009, the UK National Institute for Biological Standards and Control wrote that a near maximum immuno stimulatory dose had been given, because a safe starting dose in man had been calculated "based upon results from pre clinical safety testing in a non responsive species" (Macaca fascicularis). It reported that the European guidelines for first in man phase I clinical trials of biologics had been revised. In 2010, the failure to predict a severe cytokine release syndrome in humans was explained. In vitro data revealed that the CD4+ effector memory T cells of Macaca fascicularis, the species of primate used for pre clinical safety testing of TGN1412, lack CD28 expression. Since CD28 is the target of the TGN1412 antibody, M. fascicularis effector T cells could not be stimulated by the drug. In 2013, it was described that standard pro inflammatory markers TNFα and IL 8 are not predictive of the unusual pro inflammatory response to TGN1412, and gave a false negative result. IL 2 release and lymphoproliferation are more helpful predictors of the response. In 2016, a study carried out on humanized mice evaluated TGN1412's effects on the immune system, and confirmed that it could cause cytokine release syndrome, destruction of white blood cells, and other negative effects observed during the initial human trial.

Противоречия

Критики утверждали, что компания должна была предвидеть, что препарат вызовет серьезную реакцию у людей. Иммунолог, с которым связался журнал New Scientist и который пожелал остаться анонимным, заявил: "Не обязательно быть ракетным ученым, чтобы понять, что произойдет, если неспецифически активировать все Т-клетки в организме". Хотя препарат казался безопасным в моделях на животных, исследователи отметили, что есть основания полагать, что эти результаты могут не отражать реакцию у людей, особенно в отношении данного типа препаратов. BBC сообщила, что "у двух из 20 обезьян, использованных в более ранних тестах, наблюдалось увеличение лимфатических узлов", но "эта информация была предоставлена испытуемым и передана регулирующим органам". TeGenero утверждала, что это было временным явлением и свидетельствовало о повышенном количестве Т-клеток, производимых препаратом. Эксперименты с другим препаратом, воздействующим на рецептор CD28 (но в меньшей степени, чем TGN1412), также показали побочные эффекты в клинических испытаниях на людях. Высказывалась критика в отношении недостаточной обоснованности принятых рисков и дизайна протокола соответствующими статистическими данными. Противники тестирования на животных приводят этот случай в качестве аргумента, что эксперименты на нечеловеческих животных, даже на видах, близких к человеку, не всегда предсказывают реакцию человека и не могут оправдать вред, причиняемый животным, или сопутствующие риски для людей. TGN1412 был разработан для идеального связывания с рецептором CD28 человека. Испытания на мышах не обязательно могли предсказать реакцию человека, поскольку для достижения аналогичного уровня иммуноактивности потребовалась бы значительно более высокая доза. Клиническое испытание TGN1412 на людях легло в основу документальной драмы BBC 2017 года "Испытание лекарства: Чрезвычайная ситуация в больнице".