Молекулярная филогенетика: анализ генетических различий для изучения эволюции.

Введение

Молекулярная филогенетика (/m//ə/'/l//ɛ//k//j//ᵿ//l//ər// /,/f//aɪ//l//oʊ//dʒ//ə/'/n//ɛ//t//ɪ//k//s//, //m//ɒ// //, //m//oʊ// /) – это раздел филогенетики, анализирующий генетические, наследственные молекулярные различия, преимущественно в последовательностях ДНК, для получения информации об эволюционных взаимосвязях организмов. На основе этих анализов можно установить процессы, посредством которых достигается разнообразие видов. Результат молекулярно-филогенетического анализа представляется в виде филогенетического дерева. Молекулярная филогенетика является одним из аспектов молекулярной систематики – более широкого термина, включающего также использование молекулярных данных в таксономии и биогеографии. Молекулярная филогенетика и молекулярная эволюция взаимосвязаны. Молекулярная эволюция – это процесс селективных изменений (мутаций) на молекулярном уровне (гены, белки и т.д.) в различных ветвях дерева жизни (эволюции). Молекулярная филогенетика делает выводы об эволюционных взаимосвязях, возникающих в результате молекулярной эволюции, и приводит к построению филогенетического дерева.

История

Теоретические основы молекулярной систематики были заложены в 1960-х годах в трудах Эмиля Цукеркандля, Эмануэля Марголиаша, Линуса Полинга и Уолтера М. Фича. Первые применения молекулярной систематики были осуществлены Чарльзом Г. Сибли (в изучении птиц), Гербертом С. Дессауэром (в герпетологии) и Моррисом Гудманом (в приматологии), за которыми последовали Аллан С. Уилсон, Роберт К. Селандер и Джон С. Авайс (исследовавшие различные группы). Работа с электрофорезом белков началась примерно в 1956 году. Хотя результаты не были количественными и первоначально не превосходили морфологическую классификацию, они дали многообещающие указания на то, что устоявшиеся представления о классификации птиц, например, нуждаются в существенной переработке. В период с 1974 по 1986 год гибридизация ДНК-ДНК была основным методом, используемым для измерения генетических различий.

Теоретическая основа

Ранние попытки молекулярной систематики также назывались химиотаксономией и использовали белки, ферменты, углеводы и другие молекулы, которые разделялись и характеризовались с использованием таких методов, как хроматография. В последнее время они в значительной степени уступили место секвенированию ДНК, которое позволяет получать точные последовательности нуклеотидов или оснований в сегментах ДНК или РНК, выделенных различными способами. В целом, секвенирование считается более эффективным для эволюционных исследований, поскольку действия эволюции в конечном итоге отражаются в генетических последовательностях. В настоящее время секвенирование всего генома организма остается длительным и дорогостоящим процессом. Однако определение последовательности определенного участка конкретной хромосомы вполне осуществимо. Типичный анализ в молекулярной систематике требует секвенирования около 1000 пар оснований. В любом положении в такой последовательности основания, встречающиеся в данной позиции, могут различаться у разных организмов. Конкретная последовательность, обнаруженная у данного организма, называется его гаплотипом. В принципе, при наличии четырех типов оснований и 1000 пар оснований, возможно существование 4<sup>1000</sup> различных гаплотипов. Однако эмпирически установлено, что у организмов в пределах одного вида или группы родственных видов лишь небольшое число участков демонстрирует какие-либо вариации, и большинство обнаруженных вариаций коррелируют между собой, поэтому количество различных гаплотипов, которые обнаруживаются, относительно невелико. В молекулярно-систематическом анализе гаплотипы определяются для определенного участка генетического материала; используется значительная выборка особей целевого вида или другого таксона; однако многие современные исследования основаны на отдельных индивидуумах. Гаплотипы также определяются для особей близкородственных, но различных таксонов. Наконец, определяются гаплотипы из небольшого числа особей принципиально другого таксона, которые называются внешней группой (outgroup). Затем сравниваются последовательности оснований гаплотипов. В простейшем случае разница между двумя гаплотипами оценивается путем подсчета числа положений, в которых они имеют разные основания: это называется числом замен (также могут возникать и другие виды различий между гаплотипами, например, вставка участка нуклеиновой кислоты в один гаплотип, отсутствующего в другом). Различие между организмами обычно перевыражается в виде процентной дивергенции, путем деления числа замен на число проанализированных пар оснований: предполагается, что эта мера будет независима от местоположения и длины секвенированного участка ДНК. Более ранний и устаревший подход заключался в определении дивергенций между генотипами особей с помощью ДНК-ДНК гибридизации. Преимуществом гибридизации по сравнению с секвенированием генов было то, что она основывалась на всем генотипе, а не на отдельных участках ДНК. Современные методы сравнения последовательностей преодолевают это возражение за счет использования множественных последовательностей. После определения дивергенций между всеми парами образцов полученная треугольная матрица различий подвергается статистическому кластерному анализу, а полученная дендрограмма исследуется, чтобы выяснить, кластеризуются ли образцы так, как ожидается, исходя из современных представлений о таксономии группы. Любая группа гаплотипов, которые более похожи друг на друга, чем любой из них на любой другой гаплотип, может считаться кладой, которая может быть визуально представлена, как показано на рисунке справа. Статистические методы, такие как бутстрэп и джекнайф, помогают в получении оценок надежности позиций гаплотипов на эволюционных деревьях.

Early attempts at molecular systematics were also termed chemotaxonomy and made use of proteins, enzymes, carbohydrates, and other molecules that were separated and characterized using techniques such as chromatography. These have been replaced in recent times largely by DNA sequencing, which produces the exact sequences of nucleotides or bases in either DNA or RNA segments extracted using different techniques. In general, these are considered superior for evolutionary studies, since the actions of evolution are ultimately reflected in the genetic sequences. At present, it is still a long and expensive process to sequence the entire DNA of an organism (its genome). However, it is quite feasible to determine the sequence of a defined area of a particular chromosome. Typical molecular systematic analyses require the sequencing of around 1000 base pairs. At any location within such a sequence, the bases found in a given position may vary between organisms. The particular sequence found in a given organism is referred to as its haplotype. In principle, since there are four base types, with 1000 base pairs, we could have 41000 distinct haplotypes. However, for organisms within a particular species or in a group of related species, it has been found empirically that only a minority of sites show any variation at all, and most of the variations that are found are correlated, so that the number of distinct haplotypes that are found is relatively small. In a molecular systematic analysis, the haplotypes are determined for a defined area of genetic material; a substantial sample of individuals of the target species or other taxon is used; however, many current studies are based on single individuals. Haplotypes of individuals of closely related, yet different, taxa are also determined. Finally, haplotypes from a smaller number of individuals from a definitely different taxon are determined: these are referred to as an outgroup. The base sequences for the haplotypes are then compared. In the simplest case, the difference between two haplotypes is assessed by counting the number of locations where they have different bases: this is referred to as the number of substitutions (other kinds of differences between haplotypes can also occur, for example, the insertion of a section of nucleic acid in one haplotype that is not present in another). The difference between organisms is usually re expressed as a percentage divergence, by dividing the number of substitutions by the number of base pairs analysed: the hope is that this measure will be independent of the location and length of the section of DNA that is sequenced. An older and superseded approach was to determine the divergences between the genotypes of individuals by DNA DNA hybridization. The advantage claimed for using hybridization rather than gene sequencing was that it was based on the entire genotype, rather than on particular sections of DNA. Modern sequence comparison techniques overcome this objection by the use of multiple sequences. Once the divergences between all pairs of samples have been determined, the resulting triangular matrix of differences is submitted to some form of statistical cluster analysis, and the resulting dendrogram is examined in order to see whether the samples cluster in the way that would be expected from current ideas about the taxonomy of the group. Any group of haplotypes that are all more similar to one another than any of them is to any other haplotype may be said to constitute a clade, which may be visually represented as the figure displayed on the right demonstrates. Statistical techniques such as bootstrapping and jackknifing help in providing reliability estimates for the positions of haplotypes within the evolutionary trees.

Методы и применения

Каждый живой организм содержит дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), рибонуклеиновую кислоту (РНК) и белки. В целом, близкородственные организмы демонстрируют высокую степень сходства в молекулярной структуре этих веществ, тогда как молекулы далёкородственных организмов часто показывают различия. Ожидается, что консервативные последовательности, такие как митохондриальная ДНК, будут накапливать мутации с течением времени, и, при условии постоянной скорости мутаций, предоставляют возможность использовать молекулярные часы для определения времени расхождения. Молекулярная филогенетика использует эти данные для построения "филогенетического дерева", отражающего вероятную эволюцию различных организмов. С изобретением секвенирования по Сэнгеру в 1977 году стало возможным выделять и идентифицировать эти молекулярные структуры. Высокопроизводительное секвенирование также может быть использовано для получения транскриптома организма, что позволяет делать выводы о филогенетических связях на основе транскриптомических данных. Наиболее распространенный подход – сравнение гомологичных последовательностей генов с использованием методов выравнивания последовательностей для выявления сходства. Другое применение молекулярной филогенетики – ДНК-штрихкодирование, при котором вид отдельного организма идентифицируется с помощью небольших фрагментов митохондриальной ДНК или ДНК хлоропластов. Еще одно применение этих технологий можно увидеть в узкой области генетики человека, например, во всё более широком использовании генетического тестирования для установления отцовства, а также в появлении нового направления криминалистической экспертизы, основанного на генетических отпечатках.

Молекулярный филогенетический анализ

Существует несколько методов, доступных для проведения молекулярного филогенетического анализа. Один из методов, включающий в себя комплексный пошаговый протокол построения филогенетического дерева, включая сборку контигуальных последовательностей ДНК/аминокислот, выравнивание множественных последовательностей, тестирование моделей (определение наиболее подходящих моделей замещения) и реконструкцию филогенеза с использованием метода максимального правдоподобия и байесовского вывода, доступен в Nature Protocol. Другая методика молекулярного филогенетического анализа была описана Певснером и будет кратко изложена в следующих предложениях (Pevsner, 2015). Филогенетический анализ обычно состоит из пяти основных этапов. Первый этап включает в себя получение последовательностей. Следующий этап заключается в выполнении выравнивания множественных последовательностей, которое является фундаментальной основой для построения филогенетического дерева. Третий этап включает различные модели замещения ДНК и аминокислот. Существует несколько моделей замещения. Примеры включают расстояние Хэмминга, модель одного параметра Джукса-Кантора и модель двух параметров Кимуры (см. Модели эволюции ДНК). Четвертый этап состоит из различных методов построения деревьев, включая методы, основанные на расстоянии и на характеристиках. Нормализованное расстояние Хэмминга и формулы коррекции Джукса-Кантора предоставляют степень дивергенции и вероятность изменения одного нуклеотида в другой, соответственно. Распространенные методы построения деревьев включают метод неподвешенной группы пар с использованием арифметического среднего (UPGMA) и метод присоединения соседей, которые являются методами, основанными на расстоянии, метод максимальной экономии, который является методом, основанным на характеристиках, и оценку максимального правдоподобия и байесовский вывод, которые являются методами, основанными на характеристиках/моделях. UPGMA – это простой метод, однако он менее точен, чем метод присоединения соседей. Наконец, последний этап включает в себя оценку деревьев. Эта оценка точности состоит из непротиворечивости, эффективности и устойчивости. MEGA (молекулярный эволюционный генетический анализ) – это удобное и бесплатное программное обеспечение для анализа, которое можно загрузить и использовать. Это программное обеспечение способно анализировать как методологии построения деревьев, основанные на расстоянии, так и методологии, основанные на характеристиках. MEGA также содержит несколько опций, которые можно выбрать для использования, таких как эвристические подходы и бутстрэп-анализ. Бутстрэп-анализ – это подход, который обычно используется для оценки устойчивости топологии филогенетического дерева, демонстрирующий процент поддержки каждого клада после многочисленных повторений. В целом, значение выше 70% считается значимым. Блок-схема справа визуально демонстрирует порядок пяти этапов методики молекулярного филогенетического анализа Певснера, которые были описаны. Метод построения деревьев также предполагает определенные предположения о топологии деревьев, скорости эволюции и выборке. Упрощенный UPGMA предполагает укорененное дерево и равномерные молекулярные часы, оба из которых могут быть неверными.

There are several methods available for performing a molecular phylogenetic analysis. One method, including a comprehensive step by step protocol on constructing a phylogenetic tree, including DNA/Amino Acid contiguous sequence assembly, multiple sequence alignment, model test (testing best fitting substitution models), and phylogeny reconstruction using Maximum Likelihood and Bayesian Inference, is available at Nature Protocol. Another molecular phylogenetic analysis technique has been described by Pevsner and shall be summarized in the sentences to follow (Pevsner, 2015). A phylogenetic analysis typically consists of five major steps. The first stage comprises sequence acquisition. The following step consists of performing a multiple sequence alignment, which is the fundamental basis of constructing a phylogenetic tree. The third stage includes different models of DNA and amino acid substitution. Several models of substitution exist. A few examples include Hamming distance, the Jukes and Cantor one parameter model, and the Kimura two parameter model (see Models of DNA evolution). The fourth stage consists of various methods of tree building, including distance based and character based methods. The normalized Hamming distance and the Jukes Cantor correction formulas provide the degree of divergence and the probability that a nucleotide changes to another, respectively. Common tree building methods include unweighted pair group method using arithmetic mean (UPGMA) and Neighbor joining, which are distance based methods, Maximum parsimony, which is a character based method, and Maximum likelihood estimation and Bayesian inference, which are character based/model based methods. UPGMA is a simple method; however, it is less accurate than the neighbor joining approach. Finally, the last step comprises evaluating the trees. This assessment of accuracy is composed of consistency, efficiency, and robustness. MEGA (molecular evolutionary genetics analysis) is an analysis software that is user friendly and free to download and use. This software is capable of analyzing both distance based and character based tree methodologies. MEGA also contains several options one may choose to utilize, such as heuristic approaches and bootstrapping. Bootstrapping is an approach that is commonly used to measure the robustness of topology in a phylogenetic tree, which demonstrates the percentage each clade is supported after numerous replicates. In general, a value greater than 70% is considered significant. The flow chart displayed on the right visually demonstrates the order of the five stages of Pevsner's molecular phylogenetic analysis technique that have been described. The tree building method also brings with it specific assumptions about tree topology, evolution speeds, and sampling. The simplistic UPGMA assumes a rooted tree and a uniform molecular clock, both of which can be incorrect.