Гепарин: История, свойства и применение антикоагулянта

Введение

Антикоагулянт

Гепарин, также известный как нефракционированный гепарин (UFH), – это лекарственное средство и природный гликозаминогликан. Гепарин является антикоагулянтом, повышающим активность антитромбина. Он используется для лечения инфаркта миокарда и нестабильной стенокардии. Его антикоагулянтные свойства делают его полезным для предотвращения свертывания крови в пробирках для взятия образцов крови и аппаратах гемодиализа. Распространенные побочные эффекты включают кровотечения, боль в месте инъекции и тромбоцитопению. Гепарин, по всей видимости, относительно безопасен при беременности и грудном вскармливании. Гепарин производится базофилами и тучными клетками у всех млекопитающих. Открытие гепарина было объявлено в 1916 году. Он входит в Список основных лекарственных средств Всемирной организации здравоохранения. Также доступна фракционированная форма гепарина, известная как гепарин низкой молекулярной массы.

История

Гепарин был открыт Джей Маклином и Уильямом Генри Хауэллом в 1916 году, хотя клинические испытания начались только в 1935 году. Первоначально он был выделен из клеток печени собаки, отсюда и его название (ἧπαρ – hēpar, греческое слово для «печени»; hepar + in). Маклин был студентом второго курса медицинского факультета Университета Джона Хопкинса и работал под руководством Хауэлла, исследуя препараты, способствующие свертыванию крови, когда он выделил жирорастворимый фосфатидный антикоагулянт из ткани печени собаки. В 1918 году Хауэлл ввел термин «гепарин» для обозначения этого типа жирорастворимого антикоагулянта. В начале 1920-х годов Хауэлл выделил водорастворимый полисахаридный антикоагулянт, который он также назвал «гепарином», хотя он отличался от ранее обнаруженных фосфатидных препаратов. Работа Маклина в качестве хирурга, вероятно, сместила фокус группы Хауэлла в сторону поиска антикоагулянтов, что в конечном итоге привело к открытию полисахарида. Первоначально считалось, что гепарин открыл Хауэлл. Однако в 1940-х годах Джей Маклин был недоволен тем, что не получил должного признания за то, что он считал своим собственным открытием. Хотя он был относительно сдержан в своих заявлениях и не хотел расстраивать своего бывшего руководителя, он читал лекции и писал письма, утверждая, что открытие принадлежит ему. Это постепенно стало общепринятым фактом, и после его смерти в 1959 году в его некрологе он был назван истинным первооткрывателем гепарина. Это было элегантно подтверждено в 1963 году на мемориальной доске, установленной в Университете Джона Хопкинса в ознаменование значительного вклада (Маклина) в открытие гепарина в 1916 году в сотрудничестве с профессором Уильямом Генри Хауэллом. В 1930-х годах несколько исследователей изучали гепарин. Эрик Йорпес из Каролинского института опубликовал свои исследования структуры гепарина в 1935 году, что позволило шведской компании Vitrum AB выпустить первый препарат гепарина для внутривенного применения в 1936 году. В период с 1933 по 1936 год Лаборатории медицинских исследований Коннота, входившие в состав Университета Торонто, разработали метод производства безопасного, нетоксичного гепарина, который можно было вводить пациентам в виде солевого раствора. Первые клинические испытания гепарина на людях начались в мае 1935 года, и к 1937 году стало ясно, что гепарин производства Коннота безопасен, легко доступен и эффективен в качестве антикоагулянта. До 1933 года гепарин был доступен в небольших количествах, был чрезвычайно дорогим и токсичным и, следовательно, не представлял медицинской ценности. Производство гепарина претерпело перебои в 1990-х годах. До этого гепарин в основном получали из тканей крупного рогатого скота, которые были побочным продуктом мясной промышленности, особенно в Северной Америке. С быстрым распространением губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота (БСЭ) все больше и больше производителей отказывались от этого источника поставок. В результате мировое производство гепарина все больше концентрировалось в Китае, где вещество теперь закупалось у развивающейся отрасли разведения и убоя свиней. Зависимость здравоохранения от мясной промышленности достигла угрожающих масштабов в связи с пандемией COVID-19. В 2020 году несколько исследований продемонстрировали эффективность гепарина в смягчении тяжелого течения заболевания, поскольку его антикоагулянтный эффект противодействовал образованию иммунотромбоза. Однако доступность гепарина на мировом рынке снизилась, поскольку одновременно с этим вспышка эпидемии гриппа у свиней привела к сокращению значительной части популяции свиней в Китае. Ситуацию усугубил тот факт, что крупные бойни по всему миру сами стали очагами коронавируса и были вынуждены временно закрыться. В менее обеспеченных странах, в результате дефицита гепарина, также ухудшилось здравоохранение, помимо лечения COVID-19, например, путем отмены операций на сердце.

Heparin was discovered by Jay McLean and William Henry Howell in 1916, although it did not enter clinical trials until 1935. It was originally isolated from dog liver cells, hence its name (ἧπαρ hēpar is Greek for 'liver'; hepar + in). McLean was a second year medical student at Johns Hopkins University, and was working under the guidance of Howell investigating pro coagulant preparations, when he isolated a fat soluble phosphatide anticoagulant in canine liver tissue. In 1918, Howell coined the term 'heparin' for this type of fat soluble anticoagulant. In the early 1920s, Howell isolated a water soluble polysaccharide anticoagulant, which he also termed 'heparin', although it was different from the previously discovered phosphatide preparations. McLean's work as a surgeon probably changed the focus of the Howell group to look for anticoagulants, which eventually led to the polysaccharide discovery. It had at first been accepted that it was Howell who discovered heparin. However in the 1940s, Jay McLean became unhappy that he had not received appropriate recognition for what he saw as his own discovery. Though relatively discreet about his claim and not wanting to upset his former chief, he gave lectures and wrote letters claiming that the discovery was his. This gradually became accepted as fact, and indeed after his death in 1959, his obituary credited him as being the true discoverer of heparin. This was elegantly restated in 1963 in a plaque unveiled in Johns Hopkins to commemorate the major contribution (of McLean) to the discovery of heparin in 1916 in collaboration with Professor William Henry Howell. In the 1930s, several researchers were investigating heparin. Erik Jorpes at Karolinska Institutet published his research on the structure of heparin in 1935, which made it possible for the Swedish company Vitrum AB to launch the first heparin product for intravenous use in 1936. Between 1933 and 1936, Connaught Medical Research Laboratories, then a part of the University of Toronto, perfected a technique for producing safe, nontoxic heparin that could be administered to patients, in a saline solution. The first human trials of heparin began in May 1935, and, by 1937, it was clear that Connaught's heparin was safe, easily available, and effective as a blood anticoagulant. Prior to 1933, heparin was available in small amounts, was extremely expensive and toxic, and, as a consequence, of no medical value. Heparin production experienced a break in the 1990s. Until then, heparin was mainly obtained from cattle tissue, which was a by product of the meat industry, especially in North America. With the rapid spread of BSE, more and more manufacturers abandoned this source of supply. As a result, global heparin production became increasingly concentrated in China, where the substance was now procured from the expanding industry of breeding and slaughtering hog. The dependence of medical care on the meat industry assumed threatening proportions in the wake of the COVID 19 pandemic. In 2020, several studies demonstrated the efficacy of heparin in mitigating severe disease progression, as its anticoagulant effect counteracted the formation of immunothrombosis. However, the availability of heparin on the world market was decreased, because concurrently a renewed swine flu epidemic had reduced significant portions of the Chinese hog population. The situation was further exacerbated by the fact that mass slaughterhouses around the world became corona hotspots themselves and were forced to close temporarily. In less affluent countries, the resulting heparin shortage also led to worsened health care beyond the treatment of covid, for example through the cancellation of cardiac surgeries.

Побочные эффекты

Серьезным побочным эффектом гепарина является гепариноиндуцированная тромбоцитопения (ГИТ), вызванная иммунологической реакцией, при которой тромбоциты становятся мишенью иммунного ответа, что приводит к их разрушению и, как следствие, к тромбоцитопении. Обычно это состояние обратимо при прекращении лечения и, как правило, может быть предотвращено при использовании синтетических гепаринов. Не у всех пациентов с гепариновыми антителами развивается тромбоцитопения. Также, доброкачественная форма тромбоцитопении может быть связана с началом применения гепарина и обычно проходит без его отмены. Примерно у трети пациентов с диагностированной гепариноиндуцированной тромбоцитопенией в конечном итоге развиваются тромботические осложнения. Известны два негеморрагических побочных эффекта лечения гепарином. Первый – повышение уровня аминотрансфераз в сыворотке крови, о котором сообщается у до 80% пациентов, получающих гепарин. Эта аномалия не связана с нарушением функции печени и исчезает после прекращения приема препарата. Другое осложнение – гиперкалиемия, которая возникает у 5–10% пациентов, получающих гепарин, и является следствием подавления альдостерона, вызванного гепарином. Гиперкалиемия может проявиться в течение нескольких дней после начала терапии гепарином. Реже, при хроническом применении могут возникать побочные эффекты, такие как алопеция и остеопороз.

Противопоказания

Гепарин противопоказан пациентам с риском кровотечений (особенно при неконтролируемом артериальном давлении, заболеваниях печени и инсульте), тяжелыми заболеваниями печени или выраженной гипертонией.

Антидот к гепарину

Протамин сульфат используется для нейтрализации антикоагулянтного эффекта гепарина (1 мг на 100 единиц гепарина, введенных за последние 6 часов). Его можно применять при передозировке гепарином или для отмены действия гепарина, когда он больше не требуется.

Физиологическая функция

Нормальная роль гепарина в организме не установлена. Гепарин обычно хранится в секреторных гранулах тучных клеток и высвобождается в сосудистую систему только в местах повреждения тканей. Предполагается, что основное назначение гепарина заключается не в антикоагуляции, а в защите этих участков от вторжения бактерий и других чужеродных веществ. Кроме того, он встречается у множества различных видов, включая некоторых беспозвоночных, не имеющих схожей системы свертывания крови. Это высокосульфатированный гликозаминогликан, обладающий самой высокой плотностью отрицательного заряда среди всех известных биологических молекул.

Фармакология

В природе гепарин является полимером с различной длиной цепи. Нефракционированный гепарин (НФГ) как фармацевтический препарат – это гепарин, который не подвергался фракционированию для выделения фракции молекул с низкой молекулярной массой. В отличие от него, гепарин с низкой молекулярной массой (LMWH) проходит фракционирование с целью сделать его фармакодинамику более предсказуемой. Часто можно использовать как НФГ, так и LMWH; в некоторых случаях одно из них предпочтительнее.

Администрация

Гепарин вводят парентерально, поскольку он не всасывается в желудочно-кишечном тракте из-за его высокого отрицательного заряда и большого размера. Его можно вводить внутривенно или подкожно; внутримышечные инъекции не рекомендуются из-за риска образования гематом. В связи с коротким периодом полувыведения гепарина, составляющим около одного часа, его необходимо вводить часто или в виде непрерывной инфузии. Период полувыведения нефракционированного гепарина составляет примерно один-два часа после инфузии, в то время как у низкомолекулярных гепаринов (НМГ) он составляет четыре-пять часов. Использование НМГ позволило перейти на однократное суточное дозирование, что исключает необходимость в непрерывной инфузии препарата. При необходимости длительной антикоагулянтной терапии гепарин часто используется только для начала лечения, до наступления эффекта от пероральных антикоагулянтов, например, варфарина. Американский колледж врачей-пульмонологов публикует клинические рекомендации по дозированию гепарина.

Методы деполимеризации

Химические или ферментативные методы деполимеризации, либо их комбинация, составляют основу большинства исследований структуры и функций гепарина и гепарансульфата (HS).

Химические

Для химической деполимеризации гепарина/ГС можно использовать азотистую кислоту. Азотистую кислоту можно использовать при pH 1,5 или при более высоком pH 4. При обоих условиях азотистая кислота вызывает деаминативное расщепление цепи. При "высоком" (4) и "низком" (1,5) pH деаминативное расщепление происходит между GlcNS GlcA и GlcNS IdoA, хотя и с более медленной скоростью при более высоком pH. Реакция деаминирования, и, следовательно, расщепление цепи, не зависят от O-сульфатации, переносимой любой из моносахаридных единиц. При низком pH деаминативное расщепление приводит к высвобождению неорганического SO4 и превращению GlcNS в ангидроманнозу (aMan). Обработка азотистой кислотой при низком pH является отличным методом для различения N-сульфатированных полисахаридов, таких как гепарин и ГС, от не N-сульфатированных полисахаридов, таких как хондроитинсульфат и дерматансульфат, которые не подвержены расщеплению азотистой кислотой.

Обнаружение в жидкостях организма

Текущие клинические лабораторные анализы для гепарина основаны на косвенной оценке эффекта препарата, а не на прямом измерении его химического содержания. К ним относятся активированное частичное тромбопластиновое время (APTT) и активность анти-Xa. Образцом выбора обычно является свежая, негемолизированная плазма крови, антикоагулированная цитратом, фторидом или оксалатом.

Другие функции

Пробирки для анализа образцов крови, вакуумные контейнеры и капилляры, в которых в качестве антикоагулянта используется соль лития гепарина (литий-гепарин), обычно маркируются зелеными наклейками и имеют зеленые крышки. Гепарин имеет преимущество перед ЭДТА в том, что не влияет на уровень большинства ионов. Однако концентрация ионизированного кальция может снижаться при слишком высокой концентрации гепарина в образце крови. Гепарин, тем не менее, может мешать проведению некоторых иммуноанализов. Поскольку обычно используется литий-гепарин, определение уровня лития в организме по этим пробиркам невозможно; для этой цели применяются вакуумные контейнеры с синими (и темно-зелеными) крышками, содержащие гепарин натрия. Кровные оксигенаторы с гепариновым покрытием используются в аппаратах искусственного кровообращения. Считается, что эти специализированные оксигенаторы улучшают общую биосовместимость и гомеостаз организма, обеспечивая характеристики, сходные с характеристиками естественного эндотелия. Гепарин может занимать участки связывания ДНК на РНК-полимеразе, препятствуя связыванию полимеразы с промоторной ДНК. Это свойство используется в различных молекулярно-биологических анализах. Распространенные диагностические процедуры требуют ПЦР-амплификации ДНК пациента, которую легко извлечь из лейкоцитов, обработанных гепарином. Это создает потенциальную проблему, поскольку гепарин может быть извлечен вместе с ДНК, и было установлено, что он вмешивается в ПЦР-реакцию даже при концентрациях 0,002 ЕД в 50 мкл реакционной смеси. Гепарин используется в качестве хроматографической смолы, выступая в роли аффинного лиганда и ионообменника. Его полианионная структура может имитировать нуклеиновые кислоты, такие как ДНК и РНК, что делает его полезным для очистки белков, связывающих нуклеиновые кислоты, включая ДНК- и РНК-полимеразы и факторы транскрипции. Специфическое сродство гепарина к VSV G, вирусного гликопротеина оболочки, часто используемого для псевдотипирования ретровирусных и лентивирусных векторов для генной терапии, позволяет использовать его для последующей очистки вирусных векторов. В настоящее время гепарин проходит клинические испытания в форме назального спрея в качестве профилактики инфекции COVID-19. Кроме того, по данным испытаний, благодаря антивирусным, противовоспалительным и антикоагулянтным эффектам, ингаляция гепарина может улучшить состояние 70% пациентов, активно инфицированных COVID-19.

Blood specimen test tubes, vacutainers, and capillary tubes that use the lithium salt of heparin (lithium heparin) as an anticoagulant are usually marked with green stickers and green tops. Heparin has the advantage over EDTA of not affecting levels of most ions. However, the concentration of ionized calcium may be decreased if the concentration of heparin in the blood specimen is too high. Heparin can interfere with some immunoassays, however. As lithium heparin is usually used, a person's lithium levels cannot be obtained from these tubes; for this purpose, royal blue topped (and dark green topped) vacutainers containing sodium heparin are used. Heparin coated blood oxygenators are available for use in heart lung machines. Among other things, these specialized oxygenators are thought to improve overall biocompatibility and host homeostasis by providing characteristics similar to those of native endothelium. The DNA binding sites on RNA polymerase can be occupied by heparin, preventing the polymerase from binding to promoter DNA. This property is exploited in a range of molecular biological assays. Common diagnostic procedures require PCR amplification of a patient's DNA, which is easily extracted from white blood cells treated with heparin. This poses a potential problem, since heparin may be extracted along with the DNA, and it has been found to interfere with the PCR reaction at levels as low as 0.002 U in a 50 μL reaction mixture. Heparin has been used as a chromatography resin, acting as both an affinity ligand and an ion exchanger. Its polyanionic structure can mimic nucleic acids like DNA and RNA, making it useful for purification of nucleic acid binding proteins including DNA and RNA polymerases and transcription factors. Heparin's specific affinity for VSV G, a viral envelope glycoprotein often used to pseudotype retroviral and lentiviral vectors for gene therapy, allows it to be used for downstream purification of viral vectors. Heparin is being trialed in a nasal spray form as prophylaxis against COVID 19 infection. Furthermore, its reported from trials that due to anti viral, anti inflammatory and its anti clotting effects its inhalation could improve at a 70% rate on patients that were actively struck by a COVID 19 infection.

Загрязнение отзывает

Учитывая животное происхождение фармацевтического гепарина, количество потенциальных примесей относительно велико по сравнению с полностью синтетическим терапевтическим средством. В диапазон возможных биологических контаминантов входят вирусы, бактериальные эндотоксины, агенты трансмиссивной губчатой энцефалопатии (ТСЭ), липиды, белки и ДНК. В процессе получения гепарина фармацевтического качества из животных тканей могут попадать примеси, такие как растворители, тяжелые металлы и посторонние катионы. Однако методы, используемые для минимизации образования и выявления и/или удаления этих контаминантов, хорошо изучены и описаны в руководствах и фармакопеях. Основная задача при анализе примесей гепарина заключается в обнаружении и идентификации структурно близких примесей. Наиболее распространенной примесью в гепарине является дерматансульфат (DS), также известный как хондроитинсульфат B. Структурным элементом DS является дисахарид, состоящий из 1,3-связанного N-ацетилгалактозамина (GalN) и остатка уроновой кислоты, соединенных через 1,4-связи для формирования полимера. DS состоит из трех возможных блоков уроновой кислоты (GlcA, IdoA или IdoA2S) и четырех возможных блоков гексозамина (GalNAc, GalNAc4S, GalNAc6S или GalNAc4S6S). Наличие идуроновой кислоты в DS отличает его от хондроитинсульфата A и C и сближает с гепарином и ГС. DS имеет общую более низкую плотность отрицательного заряда по сравнению с гепарином. DS, распространенный природный контаминант, присутствует в гепариновом API в концентрации 1–7%, но не обладает доказанной биологической активностью, влияющей на антикоагулянтный эффект гепарина. В декабре 2007 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) отозвало партию гепарина из-за роста бактерий (Serratia marcescens) в нескольких невскрытых шприцах данного продукта. S. marcescens может привести к угрожающим жизни повреждениям и/или смерти.

В 2008 году из-за фальсификации наркотиков из Китая

В марте 2008 года FDA объявило о крупных отзывах гепарина в связи с обнаружением загрязнения в партиях сырья, импортированного из Китая. По данным FDA, фальсифицированный гепарин стал причиной смерти около 80 человек в Соединенных Штатах. Загрязняющим веществом было идентифицировано "чрезмерно сульфатированное" производное хондроитинсульфата – популярной биологически активной добавки, получаемой из моллюсков и часто используемой при артрите, – которое было добавлено для подмены настоящего гепарина в тестах на потенцию. Как сообщила газета The New York Times: "Сообщения о проблемах с гепарином, поступившие в агентство, включали затрудненное дыхание, тошноту, рвоту, обильное потоотделение и резкое падение артериального давления, в некоторых случаях приводившее к опасности для жизни шоку".

Использование в убийстве

В 2006 году Петр Зеленка, медбрат из Чехии, умышленно вводил пациентам большие дозы лекарственных препаратов, убив семерых и предприняв попытку убить еще десять.

Проблемы с передозировкой

В 2007 году медсестра из медицинского центра Cedars Sinai по ошибке ввела 12-дневным близнецам актера Денниса Квейда дозу гепарина, которая в 1000 раз превышала рекомендованную для младенцев. Утверждается, что передозировка произошла из-за схожей маркировки и дизайна версий препарата для взрослых и детей. Семья Квейдов подала иск к производителю, Baxter Healthcare Corp., и заключила мировое соглашение с больницей на сумму 750 000 долларов. До инцидента с Квейдами передозировку получили шесть новорожденных в больнице Методистов в Индианаполисе, штат Индиана. Трое из них умерли в результате ошибки. В июле 2008 года в больнице Christus Spohn Hospital South в Корпус-Кристи, штат Техас, умерла еще одна пара близнецов после случайного введения передозировки препарата. Передозировка была вызвана ошибкой при смешивании лекарства в больничной аптеке и не была связана с упаковкой или маркировкой продукта. По состоянию на 2008 год точная причина смерти близнецов расследовалась. В марте 2010 года двухлетнему пациенту из Техаса, перенесшему трансплантацию, в Медицинском центре Университета Небраски была введена смертельная доза гепарина. Точные обстоятельства его смерти все еще расследуются.

Производство

Гепарин фармацевтического качества получают из слизистых тканей убитых сельскохозяйственных животных, таких как свиные кишки или легкие крупного рогатого скота. Достижения в области синтетического производства гепарина были сделаны в 2003 и 2008 годах. В 2011 году был описан химиоэнзимный процесс синтеза гепаринов с низкой молекулярной массой из простых дисахаридов.