Антинуклеарные антитела: диагностика и значение в аутоиммунных заболеваниях.

Введение

Автоантитело, связывающееся с содержимым ядра клетки.

Антинуклеарные антитела (АНА, также известные как антиядерный фактор или АНФ) – это аутоантитела, которые связываются с содержимым ядра клетки. У здоровых людей иммунная система вырабатывает антитела к чужеродным белкам (антигенам), но не к собственным белкам человека (автоантигенам). Однако в некоторых случаях могут вырабатываться антитела к человеческим антигенам. Существует множество подтипов АНА, таких как анти-Ro антитела, анти-La антитела, анти-Sm антитела, анти-nRNP антитела, анти-Scl 70 антитела, анти-dsDNA антитела, антигистонные антитела, антитела к ядерным порам, антицентромерные антитела и анти-sp100 антитела. Каждый из этих подтипов антител связывается с различными белками или белковыми комплексами внутри ядра. Они обнаруживаются при многих заболеваниях, включая аутоиммунные заболевания, рак и инфекции, при этом частота встречаемости антител варьируется в зависимости от конкретного состояния. Это позволяет использовать АНА в диагностике некоторых аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка, синдром Шегрена, склеродермия, смешанное заболевание соединительной ткани, полимиозит, дерматомиозит, аутоиммунный гепатит и лекарственно-индуцированная волчанка. Анализ на АНА позволяет выявить аутоантитела, присутствующие в сыворотке крови пациента. Наиболее распространенными методами для обнаружения и количественной оценки АНА являются непрямая иммунофлуоресценция и фермент-связанный иммуносорбентный анализ (ЭЛИЗА). При иммунофлуоресценции уровень аутоантител определяется как титр – это максимальное разведение сыворотки, при котором аутоантитела все еще обнаруживаются. Положительные титры аутоантител при разведении 1:160 или выше обычно считаются клинически значимыми. Положительные титры ниже 1:160 встречаются у до 20% здорового населения, особенно у пожилых людей. Хотя титры 1:160 и выше тесно связаны с аутоиммунными заболеваниями, они также обнаруживаются у 5% здоровых людей. Скрининг на аутоантитела полезен для диагностики аутоиммунных заболеваний, а мониторинг их уровня помогает прогнозировать прогрессирование заболевания. Положительный результат анализа на АНА редко бывает полезен, если отсутствуют другие клинические или лабораторные данные, подтверждающие диагноз.

Antinuclear antibodies (ANAs, also known as antinuclear factor or ANF) are autoantibodies that bind to contents of the cell nucleus. In normal individuals, the immune system produces antibodies to foreign proteins (antigens) but not to human proteins (autoantigens). In some cases, antibodies to human antigens are produced. There are many subtypes of ANAs such as anti Ro antibodies, anti La antibodies, anti Sm antibodies, anti nRNP antibodies, anti Scl 70 antibodies, anti dsDNA antibodies, anti histone antibodies, antibodies to nuclear pore complexes, anti centromere antibodies and anti sp100 antibodies. Each of these antibody subtypes binds to different proteins or protein complexes within the nucleus. They are found in many disorders including autoimmunity, cancer and infection, with different prevalences of antibodies depending on the condition. This allows the use of ANAs in the diagnosis of some autoimmune disorders, including systemic lupus erythematosus, Sjögren syndrome, scleroderma, mixed connective tissue disease, polymyositis, dermatomyositis, autoimmune hepatitis and drug induced lupus. The ANA test detects the autoantibodies present in an individual's blood serum. The common tests used for detecting and quantifying ANAs are indirect immunofluorescence and enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). In immunofluorescence, the level of autoantibodies is reported as a titre. This is the highest dilution of the serum at which autoantibodies are still detectable. Positive autoantibody titres at a dilution equal to or greater than 1:160 are usually considered as clinically significant. Positive titres of less than 1:160 are present in up to 20% of the healthy population, especially the elderly. Although positive titres of 1:160 or higher are strongly associated with autoimmune disorders, they are also found in 5% of healthy individuals. Autoantibody screening is useful in the diagnosis of autoimmune disorders and monitoring levels helps to predict the progression of disease. A positive ANA test is seldom useful if other clinical or laboratory data supporting a diagnosis are not present.

Иммунитет и аутоиммунитет

В человеческом организме существует множество защитных механизмов против патогенов, одним из которых является гуморальный иммунитет. Этот механизм защиты вырабатывает антитела (крупные гликопротеины) в ответ на иммунный стимул. Для осуществления этого процесса требуется множество клеток иммунной системы, включая лимфоциты (Т-клетки и В-клетки) и антигенпрезентирующие клетки. Эти клетки координируют иммунный ответ при обнаружении чужеродных белков (антигенов), производя антитела, которые связываются с этими антигенами. В нормальных физиологических условиях лимфоциты, распознающие белки организма (автоантигены), либо подвергаются запрограммированной клеточной смерти (апоптозу), либо становятся нефункциональными. Эта самотолерантность означает, что лимфоциты не должны вызывать иммунный ответ против клеточных антигенов организма. Однако, иногда этот процесс нарушается, и вырабатываются антитела против собственных антигенов, что может привести к аутоиммунным заболеваниям.

Экстрагируемые ядерные антигены

Экстрагируемые ядерные антигены (ЭНА) – это группа аутоантигенов, первоначально идентифицированных как мишени антител у людей с аутоиммунными заболеваниями. Они получили название ЭНА, поскольку могут быть извлечены из клеточного ядра с помощью солевого раствора. ЭНА состоят из рибонуклеопротеинов и негистонных белков, названных либо по имени донора, предоставившего прототип сыворотки (Sm, Ro, La, Jo), либо по названию заболевания, при котором были обнаружены соответствующие антитела (SS A, SS B, Scl 70).

Анти-Ro/SS-A и анти-La/SS-B

Антитела к Ro и антитела к La, также известные как SS A и SS B соответственно, часто обнаруживаются при первичном синдроме Шёгрена – аутоиммунном заболевании, поражающем экзокриновые железы. Оба антитела присутствуют у 30–60% пациентов с синдромом Шёгрена, антитела к Ro обнаруживаются у 50–70% пациентов с синдромом Шёгрена и у 30% пациентов с системной красной волчанкой (СКВ) с поражением кожи, а антитела к La редко встречаются изолированно. Антитела к La также обнаруживаются при СКВ, однако обычно сопутствует и синдром Шёгрена. Антитела к Ro реже встречаются при других заболеваниях, включая аутоиммунные заболевания печени, целиакию, аутоиммунные ревматические заболевания, неонатальную волчанку с поражением сердца и полимиозит. Во время беременности антитела к Ro могут проникать через плаценту и вызывать блокаду сердца и неонатальную волчанку у новорожденных. При синдроме Шёгрена антитела к Ro и антитела к La коррелируют с ранним началом заболевания, большей продолжительностью болезни, увеличением околоушных желез, проявлениями заболевания за пределами желез и инфильтрацией желез лимфоцитами. Механизм выработки антител при синдроме Шёгрена полностью не выяснен, но апоптоз (программируемая гибель клеток) и молекулярная мимикрия могут играть роль. Молекулярные и эпидемиологические исследования позволяют предположить, что антитела к Sm могут индуцироваться молекулярной мимикрией, поскольку этот белок демонстрирует некоторое сходство с белками вируса Эпштейна-Барр.

Анти-nRNP/анти-U1-RNP

Антитела к ядерному рибонуклеопротеину (анти-nRNP), также известные как анти-U1 RNP антитела, обнаруживаются у 30–40% пациентов с системной красной волчанкой (СКВ). Они часто встречаются совместно с антителами к Sm, но могут быть связаны с различными клиническими проявлениями. Помимо СКВ, эти антитела тесно связаны со смешанным заболеванием соединительной ткани. Антитела к nRNP распознают основные A и C комплексы малых ядерных рибонуклеопротеинов (snRNP) и вследствие этого преимущественно связываются с U1 snRNP. Иммунный ответ на RNP может быть обусловлен представлением ядерных компонентов на клеточной мембране в апоптотических тельцах. Молекулярная мимикрия также предложена в качестве возможного механизма продукции антител к этим белкам из-за сходства между полипептидами U1 RNP и полипептидами вируса Эпштейна-Барр.

Анти-Scl-70/анти-топоизомераза I

Антитела к Scl 70 ассоциированы со склеродермией. Чувствительность этих антител к склеродермии составляет около 34%, но она выше при диффузном поражении кожи (40%) и ниже при ограниченном поражении кожи (10%). Специфичность антител составляет 98% при других ревматических заболеваниях и 99,6% у здоровых людей. Помимо склеродермии, эти антитела обнаруживаются приблизительно у 5% пациентов с системной красной волчанкой (СКВ). Антигенной мишенью антител к Scl 70 является топоизомераза I.

Анти-Джо-1

Хотя антитела к Jo-1 часто включаются в анализ на антинуклеарные антитела (ANA), на самом деле они являются антителами к цитоплазматическому белку – гистидил-тРНК-синтетазе, аминоацил-тРНК-синтетазе, необходимой для синтеза тРНК, заряженной гистидином.

Анти-dsDNA

Антитела к двухцепочечной ДНК (анти-dsDNA) тесно связаны с системной красной волчанкой (СЛЭ). Они являются высокоспецифичным маркером этого заболевания, и некоторые исследования указывают на специфичность, близкую к 100%. Также возможно, что антитела к dsDNA интернализуются клетками при связывании с мембранными антигенами и затем экспонируются на клеточной поверхности. Это может усиливать воспалительные реакции Т-клеток в почках. Важно отметить, что не все антитела к dsDNA связаны с волчаночным нефритом, и другие факторы могут вызывать этот симптом даже при их отсутствии. Антигеном для антител к dsDNA является двухцепочечная ДНК.

Антитела против гистонов

Антигистоновые антитела обнаруживаются в сыворотке крови до 75–95% людей с лекарственно-индуцированной волчанкой и 75% пациентов с идиопатической СКВ. В отличие от анти-дсДНК-антител при СКВ, эти антитела не связывают комплемент. Хотя они наиболее часто встречаются при лекарственно-индуцированной волчанке, они также обнаруживаются в некоторых случаях СКВ, склеродермии, ревматоидного артрита и недифференцированных заболеваний соединительной ткани. Многие лекарственные препараты, как известно, вызывают лекарственно-индуцированную волчанку и создают различные антигенные детерминанты в нуклеосоме, которые часто проявляют перекрестную реактивность с несколькими гистонными белками и ДНК. Прокаинамид вызывает форму лекарственно-индуцированной волчанки, которая производит антитела к комплексу гистонов H2A и H2B.

Анти-gp210 и анти-p62

Антитела к гликопротеину 210 (анти-gp210) и антинуклеопорину 62 (анти-p62) являются антителами к компонентам ядерной мембраны и обнаруживаются при первичном билиарном циррозе (ПБК). Каждое из этих антител присутствует примерно у 25–30% пациентов с ПБК. Антигены обоих антител входят в состав ядерной мембраны. gp210 – это белок массой 200 кДа, участвующий в закреплении компонентов ядерной поры на ядерной мембране. Антиген p62 представляет собой комплекс ядерной поры массой 60 кДа.

Антитела против центромера

Антитела к центромерам ассоциированы с ограниченным кожным системным склерозом, также известным как синдром CREST, первичным билиарным циррозом и проксимальной склеродермией. Существует шесть известных антигенов, все связанные с центромерой: CENP A – CENP F. CENP A – это белок, подобный гистону H3, размером 17 кДа. CENP B – это ДНК-связывающий белок массой 80 кДа, участвующий в компактизации гетерохроматина. CENP C – это белок массой 140 кДа, участвующий в сборке кинетохоров. CENP D – это белок массой 50 кДа с неизвестной функцией, но предположительно гомологичен другому белку, участвующему в конденсации хроматина, RCC1. CENP E – это белок массой 312 кДа из семейства моторных белков кинезинов. CENP F – это белок массой 367 кДа из ядерной матрицы, который ассоциируется с кинетохором в поздней фазе G2 во время митоза. Антитела к CENP A, B и C встречаются наиболее часто (в 16–42% случаев системного склероза) и ассоциированы с феноменом Рейно, телеангиэктазиями, поражением легких и ранним началом системного склероза.

Анти-sp100

Антитела к sp100 обнаруживаются примерно у 20–30% пациентов с первичным билиарным циррозом (ПБК). Они редко встречаются у людей, не страдающих ПБК, и поэтому являются высокоспецифичным маркером этого заболевания. Антиген sp100 локализуется в ядерных тельцах – крупных белковых комплексах в ядре, которые могут играть роль в росте и дифференцировке клеток.

Анти-ПМ-Скл

Антитела к PM Scl обнаруживаются у до 50% пациентов с синдромом перекреста полимиозита и системной склерозы (PM/SSc). Примерно у 80% людей, у которых эти антитела присутствуют в сыворотке крови, развивается это заболевание. Обнаружение антител связано с ограниченным поражением кожи при синдроме перекреста PM/SSc. Антигенными мишенями этих антител являются компоненты комплекса экзосомы, участвующего в обработке РНК в ядрышке.

Антитела против DFS70

Антитела к DFS70 формируют плотный мелкозернистый рисунок при непрямой иммунофлуоресценции и обнаруживаются как у здоровых людей, так и при различных состояниях, но не ассоциированы с системной аутоиммунной патологией. Следовательно, их можно использовать для исключения таких состояний у пациентов с положительным результатом анализа на ANA. Значительное количество пациентов диагностируется с системной красной волчанкой или недифференцированным заболеванием соединительной ткани, в основном на основании положительного результата анализа на ANA. Если не удается выявить специфических аутоантител (например, анти-ENA антител), рекомендуется определение антител к DFS70 для уточнения диагноза. Тесты на антитела к DFS70 доступны с CE-маркировкой. На данный момент не существует методов, одобренных FDA.

Испытание ANA

Наличие АНА в крови может быть подтверждено скрининговым тестом. Хотя существует множество тестов для выявления АНА, наиболее часто используемыми для скрининга являются непрямая иммунофлуоресценция и иммуноферментный анализ (ELISA). После обнаружения АНА определяют различные подтипы. Уровень антител анализируют, проводя серийные разведения сыворотки крови. Тест на АНА считается положительным, если при титре 1:40/1:80 наблюдается флуоресценция. Более высокие титры имеют большее клиническое значение, так как низкие положительные результаты (≤1:160) встречаются у до 20% здоровых людей, особенно пожилых. Лишь у около 5% здоровой популяции титры АНА достигают 1:160 и выше.

HEp-2

До 1975 года, когда были введены клетки HEp 2, ткани животных использовались в качестве стандартного субстрата для иммунофлуоресценции. Изначально это был штамм рака гортани, однако клеточная линия была контаминирована и замещена клетками HeLa, и в настоящее время идентифицирована как клетки HeLa. Они превосходят ранее использовавшиеся ткани животных благодаря своему большому размеру и высокой скорости митоза (деления клеток) в клеточной линии. Это позволяет обнаруживать антитела к митоз-специфическим антигенам, таким как антитела к центромерам. Они также позволяют идентифицировать анти-Ro антитела, поскольку для фиксации клеток используется ацетон (другие фиксаторы могут вымывать антиген). На клетках HEp 2 наблюдается множество паттернов ядерного окрашивания: однородный, зернистый, нуклеолярный, ядерно-мембранный, центромерный, ядерные точки и плеоморфный. Однородный паттерн наблюдается при окрашивании конденсированных хромосом и интерфазного хроматина. Этот паттерн связан с анти-dsDNA антителами, антителами к нуклеосомным компонентам и антигистоновыми антителами. Существуют два типа зернистого паттерна: мелкий и крупный. Мелкий зернистый паттерн характеризуется тонким ядерным окрашиванием с неокрашенным метафазовым хроматином, что связано с анти-Ro и анти-La антителами. Крупный зернистый паттерн проявляется в виде грубого гранулярного ядерного окрашивания, вызванного анти-U1 RNP и анти-Sm антителами. Нуклеолярный паттерн связан со многими антителами, включая анти-Scl 70, анти-PM Scl, антифибрилларин и анти-Th/To. Ядерно-мембранное окрашивание проявляется в виде флуоресцентного кольца вокруг ядра клетки и индуцируется анти-gp210 и анти-p62 антителами. Центромерный паттерн демонстрирует множественные ядерные точки в интерфазных и митотических клетках, соответствующие числу хромосом в клетке. Паттерн ядерных точек проявляется в виде от 13 до 25 ядерных точек в интерфазных клетках и индуцируется анти-sp100 антителами. Плеоморфный паттерн вызван антителами к пролиферативному клеточному ядерному антигену. Показано, что непрямая иммунофлуоресценция незначительно превосходит ELISA в обнаружении ANA из клеток HEp 2.

Until around 1975, when HEp 2 cells were introduced, animal tissue was used as the standard substrate for immunofluorescence. Originally started a laryngeal carcinoma strain, the cell line was contaminated and displaced by HeLa cells, and has now been identified as actually HeLa cells. They are superior to the previously used animal tissues because of their large size and the high rate of mitosis (cell division) in the cell line. This allows the detection of antibodies to mitosis specific antigens, such as centromere antibodies. They also allow identification of anti Ro antibodies, because acetone is used for fixation of the cells (other fixatives can wash the antigen away). There are many nuclear staining patterns seen on HEp 2 cells: homogeneous, speckled, nucleolar, nuclear membranous, centromeric, nuclear dot and pleomorphic. The homogeneous pattern is seen when the condensed chromosomes and interphase chromatin stain. This pattern is associated with anti dsDNA antibodies, antibodies to nucleosomal components, and anti histone antibodies. There are two speckled patterns: fine and coarse. The fine speckled pattern has fine nuclear staining with unstained metaphase chromatin, which is associated with anti Ro and anti La antibodies. The coarse staining pattern has coarse granular nuclear staining, caused by anti U1 RNP and anti Sm antibodies. The nucleolar staining pattern is associated with many antibodies including anti Scl 70, anti PM Scl, anti fibrillarin and anti Th/To. Nuclear membrane staining appears as a fluorescent ring around the cell nucleus and are produced by anti gp210 and anti p62 antibodies. The centromere pattern shows multiple nuclear dots in interphase and mitotic cells, corresponding to the number of chromosomes in the cell. Nuclear dot patterns show between 13 and 25 nuclear dots in interphase cells and are produced by anti sp100 antibodies. Pleomorphic pattern is caused by antibodies to the proliferating cell nuclear antigen. Indirect immunofluorescence has been shown to be slightly superior compared to ELISA in detection of ANA from HEp 2 cells.

ЭЛИСА

Иммуноферментный анализ (ИФА) использует микротитровые пластины, покрытые антигенами, для обнаружения АНА. Каждый колодец микротитровой пластины покрыт либо одним антигеном, либо несколькими антигенами для обнаружения специфических антител или скрининга на АНА соответственно. Антигены получают из клеточных экстрактов или являются рекомбинантными. Сыворотка крови инкубируется в колодцах пластины и промывается. Если присутствуют антитела, связывающиеся с антигеном, они остаются после промывки. Затем добавляется вторичное антитело к человеческим антителам, конъюгированное с ферментом, таким как хрен-пероксидаза. Ферментная реакция вызывает изменение цвета раствора, пропорциональное количеству антител, связанных с антигеном. Существуют значительные различия в обнаружении АНА методом иммунофлуоресценции и с помощью различных наборов ИФА, и степень их согласованности невелика. Клиницисту необходимо знать об этих различиях для оценки результатов различных анализов. || – У пациентов с аутоиммунным заболеванием щитовидной железы были выявлены положительные АНА и анти-ДНК антитела. Положительный результат на АНА может наблюдаться у до 45% людей с аутоиммунными заболеваниями щитовидной железы или ревматоидным артритом и у до 15% людей с ВИЧ или гепатитом С. Согласно данным Lupus Foundation of America, "около 5% населения в целом имеют положительный результат АНА. Однако, по крайней мере, 95% людей с положительным результатом АНА не страдают волчанкой. Положительный результат АНА может встречаться в семьях, даже если у членов семьи нет признаков волчанки". В 1957 году Holborow и соавторы впервые продемонстрировали АНА с использованием непрямой иммунофлуоресценции. Это было первым указанием на то, что процессы, затрагивающие ядро клетки, ответственны за развитие системной красной волчанки (СКВ). В 1959 году было обнаружено, что сыворотка людей с СКВ содержит антитела, которые осаждаются солевыми экстрактами ядер, известные как экстрагируемые ядерные антигены (ЭНА). Это привело к характеристике антигенов ЭНА и соответствующих им антител. Таким образом, анти-Sm и анти-RNP антитела были обнаружены в 1966 и 1971 годах соответственно. В 1970-х годах были обнаружены антитела anti-Ro/anti-SS A и anti-La/anti-SS B. Антитело Scl 70 было известно как специфическое для склеродермии в 1979 году, однако антиген (топоизомераза I) был охарактеризован только в 1986 году. Антиген и антитело Jo 1 были охарактеризованы в 1980 году.

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) uses antigen coated microtitre plates for the detection of ANAs. Each well of a microtitre plate is coated with either a single antigen or multiple antigens to detect specific antibodies or to screen for ANAs, respectively. The antigens are either from cell extracts or recombinant. Blood serum is incubated in the wells of the plate and is washed out. If antibodies that bind to antigen are present then they will remain after washing. A secondary anti human antibody conjugated to an enzyme such as horseradish peroxidase is added. The enzyme reaction will produce a change in colour of the solution that is proportional to the amount of antibody bound to the antigen. There are significant differences in the detection of ANA by immunofluorescence and different ELISA kits and there is only a marginal agreement between these. A clinician must be familiar with the differences in order to evaluate the outcomes of the various assays. || – Positive ANA as well as anti DNA antibodies have been reported in patients with autoimmune thyroid disease. ANA can have a positive test result in up to 45% of people with autoimmune thyroid conditions or rheumatoid arthritis and up to 15% of people with HIV or hepatitis C. As per Lupus Foundation of America, "about 5% of the general population will have a positive ANA. However, at least 95% of the people who have a positive ANA do not have lupus. A positive ANA test can sometimes run in families, even if family members have no evidence of lupus." In 1957 Holborow et al. first demonstrated ANA using indirect immunofluorescence. This was the first indication that processes affecting the cell nucleus were responsible for SLE. In 1959 it was discovered that serum from individuals with SLE contained antibodies that precipitated with saline extracts of nuclei, known as extractable nuclear antigens (ENAs). This led to the characterisation of ENA antigens and their respective antibodies. Thus, anti Sm and anti RNP antibodies were discovered in 1966 and 1971, respectively. In the 1970s, the anti Ro/anti SS A and anti La/anti SS B antibodies were discovered. The Scl 70 antibody was known to be a specific antibody to scleroderma in 1979, however the antigen (topoisomerase I) was not characterised until 1986. The Jo 1 antigen and antibody were characterised in 1980.