Биологическое окисление аммония до нитрата: нитрификация и ее участники

Введение

Биологическое окисление аммиака/аммония до нитрата

Нитрификация – это биологическое окисление аммиака до нитрата через промежуточное соединение – нитрит. Нитрификация является важным этапом в круговороте азота в почве. Процесс полной нитрификации может осуществляться разными организмами или целиком внутри одного организма, как у коммаммокс-бактерий. Преобразование аммиака в нитрит обычно является лимитирующей стадией нитрификации. Нитрификация – это аэробный процесс, осуществляемый небольшими группами автотрофных бактерий и архей.

Окисление аммиаком

Процесс нитрификации начинается с первой стадии окисления аммиака, где аммиак (NH3) или аммоний (NH4+) превращаются в нитрит (NO2-). Эта первая стадия иногда называется нитритированием. Её осуществляют две группы организмов: аммиак-окисляющие бактерии (AOB) и аммиак-окисляющие археи (AOA).

Окислительные бактерии аммиака

Окислительные бактерии аммиака (AOB) обычно являются грамотрицательными бактериями и относятся к бетапротеобактериям и гаммапротеобактериям, включая широко изучаемые роды, такие как Nitrosomonas и Nitrococcus. Они известны своей способностью использовать аммиак в качестве источника энергии и широко распространены в различных средах, таких как почвы, водные экосистемы и очистные сооружения. AOB обладают ферментами, называемыми аммиачными монооксигеназами (AMOs), которые катализируют превращение аммиака в гидроксиламин (NH2OH) – ключевой промежуточный продукт в процессе нитрификации. Эта ферментативная активность чувствительна к факторам окружающей среды, таким как pH, температура и доступность кислорода. AOB играют важную роль в нитрификации почвы, являясь ключевыми участниками круговорота питательных веществ. Они способствуют превращению аммиака, образующегося при разложении органического вещества или из удобрений, в нитрит, который затем служит субстратом для нитритоокисляющих бактерий (NOB).

Окисляющие аммиак археи

До открытия архей, способных к окислению аммиака, окисляющие аммиак бактерии (AOB) считались единственными организмами, осуществляющими окисление аммиака. С момента их открытия в 2005 году были культивированы два изолята АОА: Nitrosopumilus maritimus и Nitrososphaera viennensis. При сравнении AOB и AOA, AOA доминируют как в почвах, так и в морских средах, что позволяет предположить, что Nitrososphaerota (ранее Thaumarchaeota) могут вносить больший вклад в окисление аммиака в этих средах и, следовательно, в окисление аммиака в целом. Однако обнаружение представителей Nitrososphaerota, не являющихся облигатными окислителями аммиака, усложняет этот вывод, равно как и одно исследование, предполагающее, что кренархеол может производиться представителями морской группы II Euryarchaeota.

Окисление нитритов

Вторая стадия нитрификации — окисление нитрита до нитрата. Этот процесс иногда называют нитратацией. Окисление нитрита осуществляют нитритоокисляющие бактерии (NOB), относящиеся к таксонам Nitrospirota, Nitrospinota, Pseudomonadota и Chloroflexota. NOB обычно встречаются в почве, геотермальных источниках, пресноводных и морских экосистемах.

Полная окисление аммиака

Окисление аммиака до нитратов за один этап одним организмом было предсказано в 2006 году и обнаружено в 2015 году у вида Nitrospira inopinata. Получение чистой культуры этого организма в 2017 году стало революцией в понимании процесса нитрификации.

История

Идея о том, что окисление аммиака в нитраты на самом деле является биологическим процессом, была впервые высказана Луи Пастером в 1862 году. Позже, в 1875 году, Александр Мюллер, проводя оценку качества воды из колодцев в Берлине, отметил, что аммиак стабилен в стерилизованных растворах, но нитрифицируется в природных водах. А. Мюллер предположил, что нитрификация, таким образом, осуществляется микроорганизмами. В 1877 году Жан Жак Шлозинг и Ахилл Мюнц, два французских агрохимика, работавших в Париже, доказали, что нитрификация действительно является микробиологически опосредованным процессом, проведя эксперименты с жидкими сточными водами и искусственным почвенным субстратом (стерильный песок с порошковым мелом). Их результаты были вскоре (в 1878 году) подтверждены Робертом Уоррингтоном, который исследовал способность к нитрификации садовой почвы на экспериментальной станции Ротхамстед в Харпендене (Англия). Р. Уоррингтон в 1879 году также сделал первое наблюдение о том, что нитрификация представляет собой двухэтапный процесс, что было подтверждено Джоном Мунро в 1886 году. Хотя в то время считалось, что двухступенчатая нитрификация разделена на отдельные фазы жизни или характеристики одного микроорганизма. Первый чистый нитрификатор (окислитель аммиака) был, вероятно, выделен в 1890 году Перси и Грейс Фрэнкленд, двумя английскими учеными из Шотландии. До этого Уоррингтон и Фрэнкленды могли лишь обогащать культуры нитрификаторов. Фрэнкленд и Фрэнкленд добились успеха, используя систему последовательных разведений с очень низкой концентрацией инокулята и длительным временем культивирования, исчисляемым годами. В том же году (1890) Сергей Виноградский заявил об изоляции чистой культуры, а уже в 1891 году это удалось С. Виноградскому. Фактически, в ходе последовательных разведений окислители аммиака и окислители нитритов были неосознанно разделены, что привело к получению чистой культуры, способной только к окислению аммиака. Таким образом, Фрэнкленды заметили, что эти чистые культуры теряют способность выполнять оба этапа. Потеря способности к окислению нитритов была уже отмечена Р. Уоррингтоном. В большинстве сред присутствуют организмы, которые завершают оба этапа процесса, образуя нитрат как конечный продукт. Однако возможно создание систем, в которых образуется нитрит (процесс Шарона). Нитрификация важна в сельскохозяйственных системах, где удобрения часто вносятся в виде аммиака. Преобразование этого аммиака в нитрат увеличивает выщелачивание азота, поскольку нитрат более растворим в воде, чем аммиак. Нитрификация также играет важную роль в удалении азота из коммунальных сточных вод. Традиционный метод удаления включает нитрификацию с последующей денитрификацией. Основные затраты этого процесса связаны с аэрацией (подача кислорода в реактор) и добавлением внешнего источника углерода (например, метанола) для денитрификации. Нитрификация может также происходить в питьевой воде. В распределительных системах, где хлорамины используются в качестве вторичного дезинфицирующего средства, наличие свободного аммиака может служить субстратом для микроорганизмов, окисляющих аммиак. Связанные с этим реакции могут привести к истощению остаточного дезинфицирующего средства в системе. Добавление ионов хлорита в воду, обработанную хлорамином, позволяет контролировать нитрификацию. Вместе с аммонификацией нитрификация образует процесс минерализации, который относится к полному разложению органического материала с высвобождением доступных соединений азота. Это восполняет цикл азота.

The idea that oxidation of ammonia to nitrate is in fact a biological process was first given by Louis Pasteur in 1862. Later in 1875, Alexander Müller, while conducting a quality assessment of water from wells in Berlin, noted that ammonium was stable in sterilized solutions but nitrified in natural waters. A. Müller put forward, that nitrification is thus performed by microorganisms. In 1877, Jean Jacques Schloesing and Achille Müntz, two French agricultural chemists working in Paris, proved that nitrification is indeed microbially mediated process by the experiments with liquid sewage and artificial soil matrix (sterilized sand with powdered chalk). Their findings were confirmed soon (in 1878) by Robert Warington who was investigating nitrification ability of garden soil at the Rothamsted experimental station in Harpenden in England. R. Warington made also the first observation that nitrification is a two step process in 1879 which was confirmed by John Munro in 1886. Although at that time, it was believed that two step nitrification is separated into distinct life phases or character traits of a single microorganism. The first pure nitrifier (ammonia oxidizing) was most probably isolated in 1890 by Percy Frankland and Grace Frankland, two English scientists from Scotland. Before that, Warington, and the Franklands were only able to enrich cultures of nitrifiers. Frankland and Frankland succeeded with a system of serial dilutions with very low inoculum and long cultivation times counting in years. Sergei Winogradsky claimed pure culture isolation in the same year (1890), S. Winogradsky succeeded just one year later in 1891. In fact, during the serial dilutions ammonia oxidizers and nitrite oxidizers were unknowingly separated resulting in pure culture with ammonia oxidation ability only. Thus Frankland and Frankland observed that these pure cultures lose ability to perform both steps. Loss of nitrite oxidation ability was observed already by R. Warington. In most environments, organisms are present that will complete both steps of the process, yielding nitrate as the final product. However, it is possible to design systems in which nitrite is formed (the Sharon process). Nitrification is important in agricultural systems, where fertilizer is often applied as ammonia. Conversion of this ammonia to nitrate increases nitrogen leaching because nitrate is more water soluble than ammonia. Nitrification also plays an important role in the removal of nitrogen from municipal wastewater. The conventional removal is nitrification, followed by denitrification. The cost of this process resides mainly in aeration (bringing oxygen in the reactor) and the addition of an external carbon source (e. g., methanol) for the denitrification. Nitrification can also occur in drinking water. In distribution systems where chloramines are used as the secondary disinfectant, the presence of free ammonia can act as a substrate for ammonia oxidizing microorganisms. The associated reactions can lead to the depletion of the disinfectant residual in the system. The addition of chlorite ion to chloramine treated water has been shown to control nitrification. Together with ammonification, nitrification forms a mineralization process that refers to the complete decomposition of organic material, with the release of available nitrogen compounds. This replenishes the nitrogen cycle.

Ингибирование окисления метана

Некоторые ингибиторы ферментативной нитрификации, такие как нитрапирин, также могут ингибировать окисление метана в метанотрофных бактериях. AMO демонстрирует схожие кинетические скорости превращения с метаноксигеназой (MMO), обнаруженной у метанотрофов, что указывает на то, что MMO является аналогичным катализатором AMO в отношении окисления метана. Более того, метанотрофные бактерии имеют много общего с окислителями, такими как *Nitrosomonas*. Ингибиторный профиль партикулярной MMO (pMMO) схож с профилем AMO, что приводит к сходству свойств между MMO у метанотрофов и AMO у автотрофов.

Опасения по поводу окружающей среды

Ингибиторы нитрификации также представляют интерес с экологической точки зрения из-за образования нитратов и закиси азота в процессе нитрификации. Закись азота (N2O), хотя её концентрация в атмосфере намного ниже, чем у CO2, обладает потенциалом глобального потепления примерно в 300 раз превышающим потенциал углекислого газа и вносит 6% в общее глобальное потепление, вызванное парниковыми газами. Это соединение также играет роль в катализе разрушения озона в стратосфере. Нитраты, являющиеся токсичным соединением для дикой природы и сельскохозяйственных животных, а также продуктом нитрификации, также вызывают опасения. Почва, состоящая из полианионных глин и силикатов, обычно имеет отрицательный заряд. Вследствие этого аммоний (NH4+) прочно связывается с почвой, в то время как нитрат-ионы (NO3−) – нет. Поскольку нитраты более подвижны, они вымываются в грунтовые воды через сельскохозяйственные стоки. Нитраты в грунтовых водах могут влиять на концентрацию в поверхностных водах либо посредством прямого взаимодействия грунтовых и поверхностных вод (например, в зонах питания рек и родниках), либо при их извлечении для использования на поверхности. Например, значительная часть питьевой воды в Соединенных Штатах поступает из грунтовых вод, однако большинство очистных сооружений сбрасывают сточные воды в поверхностные водоемы. Дикие животные, такие как амфибии, пресноводные рыбы и насекомые, чувствительны к уровню нитратов, и известно, что они могут вызывать гибель и нарушения развития у пораженных видов. Уровень нитратов также способствует эвтрофикации – процессу, при котором массовое размножение водорослей снижает уровень кислорода в водоемах и приводит к гибели кислородозависимых организмов из-за аноксии. Считается, что нитрификация также способствует образованию фотохимического смога, приземного озона, кислотных дождей, изменениям в видовом разнообразии и другим нежелательным процессам. Кроме того, ингибиторы нитрификации также показали способность подавлять окисление метана (CH4) – мощного парникового газа – до CO2. Как нитрапирин, так и ацетилен являются особенно эффективными подавителями обоих процессов, хотя механизмы их действия, отличающие друг от друга, остаются неясными.

Nitrification inhibitors are also of interest from an environmental standpoint because of the production of nitrates and nitrous oxide from the process of nitrification. Nitrous oxide (N2O), although its atmospheric concentration is much lower than that of CO2, has a global warming potential of about 300 times greater than carbon dioxide and contributes 6% of planetary warming due to greenhouse gases. This compound is also notable for catalyzing the breakup of ozone in the stratosphere. Nitrates, a toxic compound for wildlife and livestock and a product of nitrification, are also of concern. Soil, consisting of polyanionic clays and silicates, generally has a net anionic charge. Consequently, ammonium (NH4+) binds tightly to the soil but nitrate ions (NO3−) do not. Because nitrate is more mobile, it leaches into groundwater supplies through agricultural runoff. Nitrates in groundwater can affect surface water concentrations, either through direct groundwater surface water interactions (e. g., gaining stream reaches, springs), or from when it is extracted for surface use. As an example, much of the drinking water in the United States comes from groundwater, but most wastewater treatment plants discharge to surface water. Wildlife such as amphibians, freshwater fish, and insects are sensitive to nitrate levels, and have been known to cause death and developmental anomalies in affected species. Nitrate levels also contribute to eutrophication, a process in which large algal blooms reduce oxygen levels in bodies of water and lead to death in oxygen consuming creatures due to anoxia. Nitrification is also thought to contribute to the formation of photochemical smog, ground level ozone, acid rain, changes in species diversity, and other undesirable processes. In addition, nitrification inhibitors have also been shown to suppress the oxidation of methane (CH4), a potent greenhouse gas, to CO2. Both nitrapyrin and acetylene are shown to be especially strong suppressors of both processes, although the modes of action distinguishing them are unclear.