Анаэробтық аммоний тотығу процесі

Кіріспе

Анаэробтық аммоний тотығу, азот циклінің микробтық процесі

Anammox – "анаэробтық аммоний тотығу" деген сөздің қысқартылған түрі, азот циклінің көптеген табиғи орталарда жүретін, әлемдік маңызы бар микробтық процесі. Бұл процесті жүзеге асыратын бактериялар 1999 жылы анықталды және ғылыми қауым үшін үлкен жаңалық болды. Anammox реакциясында нитрит және аммоний иондары тікелей диатомдық азот пен суға айналады. Anammox процесін орындайтын бактериялар Planctomycetota бактериялар тобына жататын туыстар. Anammox бактерияларының барлығында анамоксосома болады – бұл цитоплазма ішіндегі липидтік екі қабатты мембранамен шектелген бөлік, онда анамоксо процесі жүреді. Анамоксосома мембраналары баспалдақ тәрізді липидтерге бай; мұндай липидтердің болуы биологияда бірегей болып табылады. "Anammox" – Делфт технологиялық университетінде әзірленген анаэробтық аммоний тотығуға негізделген аммонийді жою технологиясының тіркелген тауарлық атауы.

Процесс туралы мәліметтер

[[Файл:Анаммокс бактериясының липидтері.png|thumb|Анаммокс бактерияларынан алынған C17 және C20 липидтері, құрамында үш тікелей біріккен циклобутан сақинасы және бір циклогексан немесе бес циклобутан сақинасы бар. Май қышқылдары метанолмен немесе глицерин тірекшесімен этерификацияланады, ал леддеран спирттері глицеринмен эфирлік байланыс арқылы қосылады, барлығы әртүрлі комбинацияларда. |NH4+ + NO2 > N2 + 2 H2O (ΔG° = 357). Жалпы, мұхиттардағы газдың 30–50% осы процестен туындауы мүмкін. Осылайша, бұл бекітілген азоттың маңызды шөгіндісі болып табылады және мұхиттың бастапқы өнімділігін шектейді. Анаммокс процесін жүзеге асыратын бактериялар Planctomycetota бактериялар тобына жатады. Қазірге дейін анамокс туыстарының бесеуі анықталды: Brocadia, Kuenenia, Anammoxoglobus, Jettenia (барлығы тұщы су түрлері) және Scalindua (теңіз түрлері). Анаммокс бактериялары бірнеше ерекше қасиеттерімен сипатталады:

Олардың барлығында анамоксосома болады – цитоплазма ішіндегі мембранамен шектелген бөлік, онда анамокс катаболизмі жүреді. Бұған қоса, бұл бактериялардың мембраналары негізінен биологияда бірегей липидтерден тұрады. Гидразинге (әдетте жоғары энергиялы ракета отыны ретінде қолданылады және көптеген тірі организмдер үшін улы) аралық зат ретінде айналуы ерекше қызығушылық тудырады. Организмінің тағы бір ерекшелігі – өте баяу өсу жылдамдығы; екі еселену уақыты 7–22 күнге жетеді. Анаммокс бактериялары субстраттарын өте төмен концентрацияда өңдеуге бейімделген; яғни, олар аммоний және нитрит субстраттарына өте жоғары сәйкестікке ие (микромолярлық диапазон). Анаммокс жасушалары цитохром c типті ақуыздармен (жалпы ақуыз құрамының ≈30%) толы, оның ішінде анамокс процесінің негізгі катаболикалық реакцияларын жүзеге асыратын ферменттер бар, бұл жасушаларды айқын қызыл түске бояйды. Анаммокс процесі алғаш рет 20 °C-тан 43 °C-қа дейінгі температурада ғана жүретіні анықталған, бірақ соңғы кезде анамокс ыстық бұлақтарда 36 °C-тан 52 °C-қа дейінгі температурада және Атлант мұхитының орталық бөлігінде орналасқан гидротермальдық қайнарларда 60 °C-тан 85 °C-қа дейінгі температурада байқалды.]]

Тарих

2-сурет. Биологиялық азот циклы, диссимиляторлық нитраттың аммонийге дейін тотығуы

1932 жылы АҚШ-тың Висконсин штатындағы Мендота көлінің шөгінділеріндегі ашыту кезінде белгісіз механизм арқылы динитроген газының пайда болғаны туралы хабарлама жарияланды. 1965 жылы Ф.А. Ричардс органикалық заттардың анаэробты реминерализациясы кезінде түзілуі тиіс аммонийдің көп бөлігі есепке алынбағанын байқады. Бұл трансформацияның белгілі биологиялық жолы болмағандықтан, аммонийдің биологиялық анаэробты тотығуына көп көңіл бөлмеді. 1977 жылы Энгельберт Брода термодинамикалық есептеулер негізінде аммонийді динитроген газына тотықтыра алатын екі хемолитоавтотрофты микроорганизмнің бар екенін болжады. Бұл реакциялардың биологиялық негізін құруға бұрынғылар тырысып, сәтсіз аяқталғандықтан, аммонийдің анаэробты тотығуы мүмкін емес деп есептелді. 1990 жылдарға қарай Арнольд Малдердің байқаулары Ричардтың ұсынысымен сәйкес келді. Олардың анаэробты денитрификациялық пилотты реакторында аммоний нитрит есебінен жоғалып, азоттың түзілуіне әкелді. Реакторда аммоний, сульфид және басқа да қосылыстар бар метаногенді пилотты реактордың шығарылған суы және нитрификациялық қондырғыдан алынған нитрат қолданылды. Бұл процеске "анаммокс" деп ат қойылды және ол қажетсіз аммонийді жоюда маңызды рөл атқаратыны анықталды. Анаммокс процесінің ашылуы алғаш рет биотехнология бойынша 5-ші еуропалық конгресте таныстырылды. 1990 жылдардың ортасында анамикстің ағынды төсектегі реакторда табылғаны жарияланды. Аммонийді жоюдың максималды жылдамдығы 0,4 кг N/м3/күн құрады. Әр моль аммонийге 0,6 моль нитрат қажет екені және нәтижесінде 0,8 моль газ түзілетіні көрсетілді. 1995 жылы анамикстің биологиялық табиғаты анықталды. 14 15 қосылған эксперименттер көрсетті, бұл жалпы таңбаланған өнімнің 98,2% құрады. Бұрынғы зерттеулерге сүйене отырып, Strous және авторлар тобы анамикс процесінің стехиометриясын массалық баланс арқылы есептеп шығарды, бұл басқа топтармен кеңінен қабылданып алынды. Кейін анамикс бактериялары Planctomycetota класына жататыны анықталды.

In 1932, it was reported that dinitrogen gas was generated via an unknown mechanism during fermentation in the sediments of Lake Mendota, Wisconsin, USA. In 1965, F. A. Richards noticed that most of the ammonium that should be produced during the anaerobic remineralization of organic matter was unaccounted for. As there was no known biological pathway for this transformation, biological anaerobic oxidation of ammonium received little further attention. In 1977, Engelbert Broda predicted the existence of two chemolithoautotrophic microorganisms capable of oxidizing ammonium to dinitrogen gas on the basis of thermodynamic calculations. It was thought that anaerobic oxidation of ammonium would not be feasible, assuming that the predecessors had tried and failed to establish a biological basis for those reactions. By the 1990s, Arnold Mulder's observations were just consistent with Richard's suggestion. In their anoxic denitrifying pilot reactor, ammonium disappeared at the expense of nitrite with a clear nitrogen production. The reactor used the effluent from a methanogenic pilot reactor, which contained ammonium, sulphide and other compounds, and nitrate from a nitrifying plant as the influent. The process was named "anammox," and was realized to have great significance in the removal of unwanted ammonium. The discovery of the anammox process was first publicly presented at the 5th European congress on biotechnology. By the mid 1990s, the discovery of anammox in the fluidized bed reactor was published. A maximum ammonium removal rate of 0.4 kg N/m3/d was achieved. It was shown that for every mole of ammonium consumed, 0.6 mol of nitrate was required, resulting in the formation of 0.8 mol of gas. In 1995, the biological nature of anammox was identified. Labeling experiments with in combination with showed that 14 15 was the dominant product making up 98.2% of the total labeled It was realized that, instead of nitrate, nitrite was assumed as the oxidizing agent of ammonium in anammox reaction. Based on a previous study, Strous et al. calculated the stoichiometry of anammox process by mass balancing, which is widely accepted by other groups. Later, anammox bacteria were identified as Planctomycetota,

2002 жылға дейін анамикс табиғи экожүйелердегі азот циклындағы шағын рөл атқарады деп есептелді. Алайда, 2002 жылы анамикс биологиялық азот циклында маңызды рөл атқаратыны анықталды, зерттелген континенттік шельф шөгінділеріндегі жалпы азот өндірісінің 24–67% құрады. Анамикс процесінің ашылуы 2-суретте көрсетілгендей биологиялық азот циклының түсінігін өзгертті.

Мүмкін болатын реакция механизмдері

бас бармағы Анамокс реакциясына қатысатын фермент жүйелерінің биохимиялық жолы және жасушалық орналасуы. бас бармағы Анамоксосомадағы гипотетикалық метаболизмдік жолдар және кері электрон тасымалы. (а) Анамоксосомалық мембранадағы протондық қозғаушы күшті құру үшін нитритті электронды қабылдаушы ретінде пайдаланатын анамокс катаболизмі. (b) Протондық қозғаушы күшпен басқарылатын кері электрон тасымалы орталық катаболизмді нитрат редуктазасымен (NAR) біріктіріп, ацетил CoA жолында көмірқышқыл газын тотықсыздандыру үшін ферродоксинді жасайды. HAO, гидразин оксидоредуктазасы; HD, гидразин дегидрогеназасы; HH, гидразин гидролазасы; NIR, нитрит оксидоредуктазасы; Q, хинин. Ашық көк ромбтар, цитохромдар; көк жебелер, тотықсызданулар; қызғылт жебелер, тотығулар. 1997 жылы жүргізілген белгілеу эксперименттеріне сәйкес, аммоний гидроксиламинмен биологиялық тотығуға ұшырайды, бұл нитриттен туындаған, ықтимал электронды қабылдаушы. Гидразиннің динитроген газына айналуы нитритті гидроксиламинге тотықсыздандыру үшін электрондық эквиваленттерді жасайтын реакция деп болжанады. Жалпы алғанда, екі мүмкін реакция механизмі қарастырылады: Бір механизм мембранаға байланысқан фермент кешені аммоний мен гидроксиламинды алдымен гидразинге, содан кейін гидразиннің периплазмада динитроген газына тотығуына айналдырады деп болжайды. Сонымен қатар, нитрит цитоплазмалық орында гидразиннің тотығуын қамтамасыз ететін бірдей фермент кешенінің әрекетімен гидроксиламинге дейін тотықсыздандырылады, бұл ішкі электрон тасымалын қамтиды (3-сурет). Екінші механизм мынадай: аммоний мен гидроксиламин мембранаға байланысқан фермент кешені арқылы гидразинге айналады, гидразин периплазмада динитроген газына тотығады, ал пайда болған электрондар цитоплазмада нитритті тотықсыздандыратын ферментке электрон тасымалдау тізбегі арқылы беріледі, онда нитрит гидроксиламинге тотықсыздандырылады (3-сурет). Нитриттің тотықсыздануы мен гидразиннің тотығуы бір ферменттің әртүрлі орындарында жүзеге асырыла ма, әлде реакциялар электрон тасымалдау тізбегі арқылы байланысқан әртүрлі фермент жүйелерімен катализдене ме, бұл әлі зерттелуде. Гидразин нитрогеназа реакциясында ферментке байланысқан аралық зат ретінде ұсынылған. Жақында Картал және әріптестер толыққанды молекулалық талдаулар мен толықтыратын әдістерді біріктіру арқылы соңғы механизмді қолдайтын мықты дәлелдерді жариялады. Сонымен қатар, гидразин өндіретін фермент – гидразин синтетазасы тазартылды және NO мен аммонийден гидразин өндіретіні көрсетілді. Хупер және басқалар анамокс процесінде азот оксидінің (NO) немесе нитроксилдің (HNO) болу мүмкіндігін аммоний монооксигеназалар отбасымен байланысты ферментте NO немесе HNO мен аммонийдің конденсациялануы арқылы ұсынды. Құрылған гидразин немесе имин кейіннен гидроксиламин оксидаза ферментімен динитроген газына айналуы мүмкін, ал реакцияда пайда болатын тотықсыздану эквиваленттері NO немесе HNO мен аммонийді біріктіруге немесе нитритті NO-ға тотықсыздандыруға қажет. *Candidatus Kuenenia stuttgartiensis* түрінің қоршаған ортаның геномдық талдауы, біршама өзгеше және толықтыратын метаболизм механизмі арқылы, гидроксиламиннің орнына аралық зат ретінде NO-ны ұсынды (4-сурет). Алайда, бұл гипотеза гидразиннің процесте маңызды аралық зат екендігімен келісті. Бұл жолда (4-сурет) анамокс бактерияларына тән екі фермент бар: гидразин синтетазасы (hzs) және гидразин дегидрогеназасы (hdh). HZS азот оксиді мен аммонийден гидразинді жасайды, ал HDH гидразиннен ферродоксинге электрондарды ауыстырады. Электронды алмасуға және катализге қатысатын домендері бар бірнеше жаңа гендер, мысалы, белгілі май қышқылдарының биосинтезі және S-аденозилметионин радикалдық фермент гендері анықталды. Тағы бір, әлі зерттелмеген реакция механизмі биоэлектр жүйелерінің анодтарында анаэробты аммонийдің тотығуын қамтиды. Мұндай жүйелер микробтық отын элементтері немесе микробтық электролиз элементтері болуы мүмкін. Ерітілген оттегі, нитрит немесе нитрат болмаған жағдайда анодты бөлікте тұратын микробтар аммонийді динитроген газына (N2) классикалық анамокс процесіндегідей тотықтай алады. Сонымен қатар, олар босатылған электрондарды анодқа түсіріп, электр тогын жасайды. Бұл электр тогын отын жадырауы режимінде немесе электролиз режимінде сутек пен метан газын өндіру үшін тікелей пайдалануға болады. *Anammoxoglobus*, бір түрі: *A. propionicus*. *Jettenia*, бір түрі: *J. asiatica*. *Scalindua*, төрт түрі: *S. brodae*, *S. sorokinii*, *S. wagneri* және *S. profunda*. Алғашқы төрт тұқымдастың өкілдері ағынды суларды тазарту станцияларының шламынан байытылды; *K. stuttgartiensis*, *B. anammoxidans*, *B. fulgida* және *A. propionicus* тіпті бірдей инокуляциядан алынған. *Scalindua* теңіз ортасында басым, бірақ кейбір тұщы су экожүйелерінде және ағынды суларды тазарту станцияларында да кездеседі. Бұл 10 түрдің барлығы анамокс биоәртүрлілігінің аз бөлігін ғана құрайды. Мысалы, қазіргі уақытта Genbank-қа (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) анамокс бактерияларымен байланысты 2000-нан астам 16S рРНА гендік тізбектері сақталған, бұл анамокс бактериялары кездесетін кең ауқымды орталарда әр түрлі нишаларды тапқан түрлердің, түршелердің және штамдардың қарастырылмаған континуумын көрсетеді. Теңіз өкілі *Scalindua* үшін түрлердің микроәртүрлілігі ерекше көзге түседі. Анамокс бактериялары арасындағы түрлердің айырмашылығын қамтамасыз ететін қоршаған орта факторлары қандай деген сұрақ әлі зерттелуде. Анамокс 16S рРНА гендерінің тізбектер арасындағы сәйкестік 87-ден 99%-ға дейін ауытқиды, ал филогенетикалық талдау оларды барлығын Planctomycetota классына жатқызады, ол Verrucomicrobia және Chlamydiae кластарымен бірге PVC суператқышын құрайды. Planctomycetota ішінде анамокс бактериялары терең тармақталған монофилеттік кладаны құрайды. Олардың филогенетикалық орны және ерекше физиологиялық, жасушалық және молекулалық қасиеттердің кең ауқымы анамокс бактерияларына өзіндік Brocadiales ордерін береді.

thumb|Figure 3. Possible biochemical pathway and cellular localization of the enzyme systems involved in anammox reaction. thumb|Figure 4. Hypothetical metabolic pathways and reversed electron transport in the anammoxosome. (a) Anammox catabolism that uses nitrite as the electron acceptor for the creation of a proton motive force over the anammoxosomal membrane. (b) Proton motive force driven reversed electron transport combines central catabolism with nitrate reductase (NAR) to generate ferredoxin for carbon dioxide reduction in the acetyl CoA pathway. HAO, hydrazine oxidoreductase; HD, hydrazine dehydrogenase; HH, hydrazine hydrolase; NIR, nitrite oxidoreductase; Q, quinine. Light blue diamonds, cytochromes; blue arrows, reductions; pink arrows, oxidations. According to labeling experiments carried out in 1997, ammonium is biologically oxidized by hydroxylamine, most likely derived from nitrite, as the probable electron acceptor. The conversion of hydrazine to dinitrogen gas is hypothesized to be the reaction that generates the electron equivalents for the reduction of nitrite to hydroxylamine. In general, two possible reaction mechanisms are addressed:

One mechanism hypothesizes that a membrane bound enzyme complex converts ammonium and hydroxylamine to hydrazine first, followed by the oxidation of hydrazine to dinitrogen gas in the periplasm. At the same time, nitrite is reduced to hydroxylamine at the cytoplasmic site of the same enzyme complex responsible for hydrazine oxidation with an internal electron transport (Figure 3a). The other mechanism postulates the following: ammonium and hydroxylamine are converted to hydrazine by a membrane bound enzyme complex, hydrazine is oxidized in the periplasm to dinitrogen gas, and the generated electrons are transferred via an electron transport chain to nitrite reducing enzyme in the cytoplasm where nitrite is reduced to hydroxylamine (Figure 3b). Whether the reduction of nitrite and the oxidation of hydrazine occur at different sites of the same enzyme or the reactions are catalyzed by different enzyme systems connected via an electron transport chain remains to be investigated. Hydrazine has been proposed as an enzyme bound intermediate in the nitrogenase reaction. Recently, using detailed molecular analyses and combining complementary methods, Kartal and coworkers published strong evidence supporting the latter mechanism. Furthermore, the enzyme producing hydrazine, hydrazine synthase was purified and shown to produce hydrazine from NO and ammonium. A possible role of nitric oxide (NO) or nitroxyl (HNO) in anammox was proposed by Hooper et al. by way of condensation of NO or HNO and ammonium on an enzyme related to the ammonium monooxygenase family. The formed hydrazine or imine could subsequently be converted by the enzyme hydroxylamine oxidase to dinitrogen gas, and the reducing equivalents produced in the reaction are required to combine NO or HNO and ammonium or to reduce nitrite to NO. Environmental genomics analysis of the species Candidatus Kuenenia stuttgartiensis, through a slightly different and complementary metabolism mechanism, suggested NO to be the intermediate instead of hydroxylamine (Figure 4). However, this hypothesis also agreed that hydrazine was an important intermediate in the process. In this pathway (Figure 4), there are two enzymes unique to anammox bacteria: hydrazine synthase (hzs) and hydrazine dehydrogenase (hdh). The HZS produces hydrazine from nitric oxide and ammonium, and HDH transfer the electrons from hydrazine to ferredoxin. Few new genes, such as some known fatty acid biosynthesis and S adenosylmethionine radical enzyme genes, containing domains involved in electron transfer and catalysis have been detected. Another, still unexplored, reaction mechanism involves anaerobic ammonium oxidation on anodes of bio electrical systems. Such systems can be microbial fuel cells or microbial electrolysis cells. In the absence of dissolved oxygen, nitrite, or nitrate, microbes living in the anode compartment are able to oxidize ammonium to dinitrogen gas (N2) just as in the classical anammox process. At the same time, they unload the liberated electrons onto the anode, producing electrical current. This electrical current can be used either directly in fuel cell mode or for hydrogen and methane gas production in electrolysis mode. Anammoxoglobus, one species: A. propionicus. Jettenia, one species: J. asiatica. Scalindua, four species: S. brodae, S. sorokinii, S. wagneri, and S. profunda. Representatives of the first four genera were enriched from sludge from wastewater treatment plants; K. stuttgartiensis, B. anammoxidans, B. fulgida, and A. propionicus were even obtained from the same inoculum. Scalindua dominates the marine environment, but is also found in some freshwater ecosystems and wastewater treatment plants. Together, these 10 species likely only represent a minute fraction of anammox biodiversity. For instance, there are currently over 2000 16S rRNA gene sequences affiliated with anammox bacteria that have been deposited to the Genbank (https://www. ncbi. nlm. nih. gov/genbank/), representing an overlooked continuum of species, subspecies, and strains, each apparently having found its specific niche in the wide variety of habitats where anammox bacteria are encountered. Species microdiversity is particularly impressive for the marine representative Scalindua. A question that remains to be investigated is which environmental factors determine species differentiation among anammox bacteria. The sequence identities of the anammox 16S rRNA genes range from 87 to 99%, and phylogenetic analysis places them all within the phylum Planctomycetota, which form the PVC superphylum together with Verrucomicrobia and Chlamydiae. Within the Planctomycetota, anammox bacteria deeply branch as a monophyletic clade. Their phylogenetic position together with a broad range of specific physiological, cellular, and molecular traits give anammox bacteria their own order Brocadiales.

Артықшылықтар

Аммиакқа бай ағынды судан дәстүрлі азотты алу екі жеке қадамнан тұрады: нитрификация, ол аэробты аммиак және нитрит тотықтырғыш бактериялар арқылы жүзеге асырылады, және денитрификация, ол нитратты электрон донорларының көмегімен қышқылданады. Аэрация және органикалық субстраттардың (әдетте метанол) енгізілуі осы екі процестің:

Энергияны көп тұтынуына себеп болады. Артық шламның пайда болуымен байланысты. Маңызды мөлшерде парниктік газдарды, мысалы, және N2O, сондай-ақ озонды бұзатын NO шығарады. Анаммокс бактериялары аммоний мен нитритті анаэробтық жағдайда тікелей түрлендіретіндіктен, бұл процеске аэрация және басқа электрон донорлары қажет емес. Дегенмен, аммиакты тотықтырғыш бактериялардың нитрит өндіруі үшін оттегі қажет. Алайда, жартылай нитрификация/анаммокс жүйелерінде оттегіге деген қажеттілік күрт төмендейді, өйткені аммонийдің тек жартысы нитратқа толық түрлендірудің орнына нитритке дейін тотықтырылуы керек. Анаммокс бактерияларының және аммиакты тотықтырғыш бактериялардың автотрофты табиғаты төмен өнімділікті және демек, шламның аз өндірілуін қамтамасыз етеді. Жалпы, ағынды суды тазартуда анамокс процесін тиімді қолдану шығындарды 60%-ға дейін төмендетуге, сондай-ақ шығарылымдарды азайтуға мүмкіндік береді. Бұл қалдық суларды тазарту реакторы үшін жеткілікті шлам өндіруді қиындатады. Сондай-ақ, шламды жазабап кеткен жағдайда қалпына келтіру уақыты дәстүрлі азотты алу жүйелерімен салыстырғанда ұзаққа созылады. Екінші жағынан, өсудің баяудығы артық шламды азайтудың артықшылығы болып табылады, оны жою және өңдеу қажет. Нақты түрге байланысты, оптималды pH деңгейі 8-ге тең. Сондықтан, ағынды судың pH деңгейін каустикалық қоспалар арқылы реттеу қажет болуы мүмкін.