Анаэробное окисление аммония: микробиологический процесс в круговороте азота

Введение

Анаэробное окисление аммония, микробиологический процесс азотного цикла.

Anammox, сокращение от "анаэробное окисление аммония", – глобально важный микробиологический процесс азотного цикла, происходящий во многих природных средах. Бактерии, осуществляющие этот процесс, были идентифицированы в 1999 году и стали настоящим сюрпризом для научного сообщества. В реакции Anammox нитриты и ионы аммония непосредственно превращаются в двухатомный азот и воду. Бактерии, выполняющие процесс Anammox, относятся к родам, принадлежащим к бактериальному типу Planctomycetota. Все бактерии Anammox содержат одну анамоксосому – компартмент, ограниченный липидной мембраной, расположенный внутри цитоплазмы, где и происходит процесс Anammox. Мембраны анамоксосом богаты лестничными липидами; наличие этих липидов пока уникально для биологии. "Anammox" также является зарегистрированным товарным знаком технологии удаления аммиака на основе Anammox, разработанной Делфтским технологическим университетом.

Основные процессы

[[Файл:Липиды ладерана бактерий анамокс. png|thumb|Ладдерные липиды C17 и C20 из бактерий анамокс, содержащие либо три линейно соединенных циклобутановых кольца и один циклогексан, либо пять циклобутановых колец. Жирные кислоты этерифицированы метанолом или глицериновым остовом, а ладдерные спирты связаны эфирной связью с глицерином, во всех возможных комбинациях. |NH4+ + NO2 > N2 + 2 H2O (ΔG° = 357). В глобальном масштабе этот процесс может отвечать за 30–50% газа, образующегося в океанах. Таким образом, это важный поглотитель фиксированного азота, что ограничивает первичную продуктивность океана. Бактерии, осуществляющие процесс анамокса, относятся к бактериальному типу Planctomycetota. В настоящее время обнаружено пять родов анамокс: Brocadia, Kuenenia, Anammoxoglobus, Jettenia (все пресноводные виды) и Scalindua (морской вид). Анамоксные бактерии характеризуются несколькими примечательными свойствами:

Все они обладают одной анамоксосомой – компартментом, ограниченным мембраной, внутри цитоплазмы, являющимся местом анамоксного катаболизма. Кроме того, мембраны этих бактерий в основном состоят из ладдерных липидов, уникальных для биологических систем. Особый интерес представляет превращение в гидразин (обычно используемый в качестве высокоэнергетического ракетного топлива и ядовитый для большинства живых организмов) в качестве промежуточного продукта. Еще одной примечательной особенностью организма является чрезвычайно медленный темп роста: время удвоения варьируется от 7 до 22 дней. Анамоксные бактерии приспособлены к преобразованию своих субстратов при очень низких концентрациях, то есть обладают очень высоким сродством к своим субстратам – аммонию и нитриту (в диапазоне субмикромолярных концентраций). Клетки анамокс насыщены белками типа цитохрома c (около 30% от общего количества белков), включая ферменты, катализирующие ключевые катаболические реакции процесса анамокса, что придает клеткам отчетливый красный цвет. Изначально процесс анамокса считался возможным только в диапазоне температур от 20 °C до 43 °C, но в последнее время анамокс наблюдался при температурах от 36 °C до 52 °C в горячих источниках и от 60 °C до 85 °C в гидротермальных источниках, расположенных вдоль Срединно-Атлантического хребта.

История

thumb|left|Биологический азотный цикл с диссимиляторным восстановлением нитрата до аммония

В 1932 году было сообщено о генерации динитрогена посредством неизвестного механизма в процессе ферментации в осадках озера Мендота (штат Висконсин, США). В 1965 году Ф. А. Ричардс заметил, что большая часть аммония, которая должна была образоваться в ходе анаэробной реминерализации органического вещества, осталась неучтенной. Поскольку известного биологического пути для этой трансформации не было, биологическое анаэробное окисление аммония не получило дальнейшего развития. В 1977 году Энгельберт Брода, основываясь на термодинамических расчетах, предсказал существование двух хемолитоавтотрофных микроорганизмов, способных окислять аммоний до динитрогена. Считалось, что анаэробное окисление аммония не представляется возможным, поскольку предшественники уже пытались, но не смогли установить биологическую основу для этих реакций. К 1990-м годам наблюдения Арнольда Малдера полностью соответствовали предположению Ричардса. В их аноксидном денитрифицирующем пилотном реакторе аммоний исчезал за счет нитрита с заметным выделением азота. Реактор использовал сточные воды из метаногенного пилотного реактора, содержащие аммоний, сульфид и другие соединения, а также нитрат из установки для нитрификации в качестве исходного потока. Этот процесс был назван "анаммокс", и стало понятно, что он имеет большое значение для удаления нежелательного аммония. Открытие процесса анаммокс было впервые представлено публике на V Европейском конгрессе по биотехнологии. К середине 1990-х годов было опубликовано открытие анаммокса в реакторе с псевдоожиженным слоем. Была достигнута максимальная скорость удаления аммония в 0,4 кг N/м³/день. Было показано, что на каждый моль потребленного аммония требуется 0,6 моль нитрата, что приводит к образованию 0,8 моль газа. В 1995 году была установлена биологическая природа анаммокса. Эксперименты с мечением в сочетании с ¹⁴N и ¹⁵N показали, что доминирующим продуктом был нитрит, составляющий 98,2% от общего количества меченых продуктов. На основе предыдущего исследования Strous и др. рассчитали стехиометрию процесса анаммокс путем баланса масс, что широко признается другими группами. Позднее анаммокс-бактерии были идентифицированы как Planctomycetota.

In 1932, it was reported that dinitrogen gas was generated via an unknown mechanism during fermentation in the sediments of Lake Mendota, Wisconsin, USA. In 1965, F. A. Richards noticed that most of the ammonium that should be produced during the anaerobic remineralization of organic matter was unaccounted for. As there was no known biological pathway for this transformation, biological anaerobic oxidation of ammonium received little further attention. In 1977, Engelbert Broda predicted the existence of two chemolithoautotrophic microorganisms capable of oxidizing ammonium to dinitrogen gas on the basis of thermodynamic calculations. It was thought that anaerobic oxidation of ammonium would not be feasible, assuming that the predecessors had tried and failed to establish a biological basis for those reactions. By the 1990s, Arnold Mulder's observations were just consistent with Richard's suggestion. In their anoxic denitrifying pilot reactor, ammonium disappeared at the expense of nitrite with a clear nitrogen production. The reactor used the effluent from a methanogenic pilot reactor, which contained ammonium, sulphide and other compounds, and nitrate from a nitrifying plant as the influent. The process was named "anammox," and was realized to have great significance in the removal of unwanted ammonium. The discovery of the anammox process was first publicly presented at the 5th European congress on biotechnology. By the mid 1990s, the discovery of anammox in the fluidized bed reactor was published. A maximum ammonium removal rate of 0.4 kg N/m3/d was achieved. It was shown that for every mole of ammonium consumed, 0.6 mol of nitrate was required, resulting in the formation of 0.8 mol of gas. In 1995, the biological nature of anammox was identified. Labeling experiments with in combination with showed that 14 15 was the dominant product making up 98.2% of the total labeled It was realized that, instead of nitrate, nitrite was assumed as the oxidizing agent of ammonium in anammox reaction. Based on a previous study, Strous et al. calculated the stoichiometry of anammox process by mass balancing, which is widely accepted by other groups. Later, anammox bacteria were identified as Planctomycetota,

До 2002 года анаммокс считался незначительным фактором в азотном цикле в природных экосистемах. Однако в 2002 году было обнаружено, что анаммокс играет важную роль в биологическом азотном цикле, обеспечивая 24–67% общего производства в изученных осадочных отложениях континентального шельфа. Открытие процесса анаммокс изменило представление о биологическом азотном цикле, как показано на рисунке 2.

Возможные механизмы реакции

Рисунок 3. Возможный биохимический путь и клеточная локализация ферментных систем, участвующих в реакции анамокса. Рисунок 4. Гипотетические метаболические пути и обратный транспорт электронов в анамоксосоме. (a) Анамоксный катаболизм, использующий нитрит в качестве акцептора электронов для создания протонного движущего градиента через анамоксосомальную мембрану. (b) Обратный транспорт электронов, обусловленный протонным движущим градиентом, сочетает центральный катаболизм с нитратредуктазой (NAR) для генерации ферредоксина для восстановления углекислого газа в ацетил-КоА пути. HAO, гидразин оксидоредуктаза; HD, гидразин дегидрогеназа; HH, гидразин гидролаза; NIR, нитрит оксидоредуктаза; Q, хинон. Светло-синие ромбы, цитохромы; синие стрелки, восстановления; розовые стрелки, окисления. Согласно экспериментам с использованием меченых соединений, проведенным в 1997 году, аммиак биологически окисляется гидроксиламином, наиболее вероятно, полученным из нитрита, в качестве вероятного акцептора электронов. Предполагается, что превращение гидразина в динитроген является реакцией, генерирующей электронные эквиваленты для восстановления нитрита в гидроксиламин. В целом рассматриваются два возможных механизма реакции: один из механизмов предполагает, что мембранно-связанный ферментный комплекс сначала преобразует аммиак и гидроксиламин в гидразин, а затем гидразин окисляется до динитрогена в периплазме. Одновременно нитрит восстанавливается до гидроксиламина в цитоплазматической части того же ферментного комплекса, который отвечает за окисление гидразина посредством внутреннего транспорта электронов (рисунок 3а). Другой механизм постулирует следующее: аммиак и гидроксиламин преобразуются в гидразин мембранно-связанным ферментным комплексом, гидразин окисляется в периплазме до динитрогена, а образовавшиеся электроны передаются по цепи переноса электронов нитритредуцирующему ферменту в цитоплазме, где нитрит восстанавливается до гидроксиламина (рисунок 3b). Остается исследовать, происходят ли восстановление нитрита и окисление гидразина в разных участках одного и того же фермента или эти реакции катализируются различными ферментными системами, соединенными цепью переноса электронов. Гидразин был предложен в качестве ферментно-связанного промежуточного соединения в реакции нитрогеназы. Недавно, используя детальный молекулярный анализ и комбинируя дополнительные методы, Картал и его коллеги опубликовали убедительные доказательства в поддержку последнего механизма. Кроме того, фермент, производящий гидразин – гидразинсинтаза, был очищен и показал способность производить гидразин из NO и аммиака. Hooper и соавторы предположили возможную роль оксида азота (NO) или нитроксила (HNO) в анамоксе посредством конденсации NO или HNO с аммиаком на ферменте, родственном семейству аммонийных монооксигеназ. Образовавшийся гидразин или иминовое соединение впоследствии может быть преобразован ферментом гидроксиламиноксидазой в динитроген, а редуцирующие эквиваленты, образующиеся в результате реакции, необходимы для объединения NO или HNO с аммиаком или восстановления нитрита до NO. Анализ геномов видов Candidatus Kuenenia stuttgartiensis выявил, что в альтернативном и дополнительном метаболическом пути NO является промежуточным продуктом вместо гидроксиламина (рисунок 4). Однако эта гипотеза также подтверждала, что гидразин является важным промежуточным продуктом в этом процессе. В этом пути (рисунок 4) присутствуют два фермента, уникальных для анамоксных бактерий: гидразинсинтаза (hzs) и гидразиндегидрогеназа (hdh). HZS производит гидразин из оксида азота и аммиака, а HDH переносит электроны из гидразина на ферредоксин. Было обнаружено несколько новых генов, таких как некоторые гены, известные в биосинтезе жирных кислот и гены радикала S-аденозилметионина, содержащие домены, участвующие в переносе электронов и катализе. Другой, пока не изученный, механизм реакции включает анаэробное окисление аммония на анодах биоэлектрических систем, таких как микробные топливные элементы или микробные электролизеры. В отсутствие растворенного кислорода, нитрита или нитрата микробы, обитающие в анодном отсеке, способны окислять аммоний до динитрогена (N2), как и в классическом анамоксном процессе. При этом они отдают освобожденные электроны на анод, генерируя электрический ток, который можно использовать непосредственно в режиме топливного элемента или для производства водорода и метана в режиме электролиза. Anammoxoglobus, один вид: A. propionicus. Jettenia, один вид: J. asiatica. Scalindua, четыре вида: S. brodae, S. sorokinii, S. wagneri и S. profunda. Представители первых четырех родов были обогащены из осадка со станций очистки сточных вод; K. stuttgartiensis, B. anammoxidans, B. fulgida и A. propionicus были даже получены из одной и той же инокуляционной культуры. Scalindua доминирует в морской среде, но также встречается в некоторых пресноводных экосистемах и на станциях очистки сточных вод. Вместе эти 10 видов, вероятно, представляют лишь незначительную часть биоразнообразия анамоксных бактерий. Например, в Genbank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) в настоящее время размещено более 2000 последовательностей гена 16S рРНК, относящихся к анамоксным бактериям, представляющих упущенный континуум видов, подвидов и штаммов, каждый из которых, по-видимому, нашел свою специфическую нишу в широком разнообразии сред обитания анамоксных бактерий. Микродверсность видов особенно впечатляет для морского представителя Scalindua. Вопрос, который остается неисследованным, заключается в том, какие факторы окружающей среды определяют дифференциацию видов среди анамоксных бактерий. Идентичность последовательностей гена 16S рРНК анамоксных бактерий варьируется от 87 до 99%, и филогенетический анализ помещает их всех в филум Planctomycetota, который вместе с Verrucomicrobia и Chlamydiae образует суперфилум PVC. Внутри Planctomycetota анамоксные бактерии глубоко ветвятся как монофилетическая клада. Их филогенетическое положение в сочетании с широким спектром специфических физиологических, клеточных и молекулярных признаков выделяет анамоксные бактерии в отдельный порядок Brocadiales.

thumb|Figure 3. Possible biochemical pathway and cellular localization of the enzyme systems involved in anammox reaction. thumb|Figure 4. Hypothetical metabolic pathways and reversed electron transport in the anammoxosome. (a) Anammox catabolism that uses nitrite as the electron acceptor for the creation of a proton motive force over the anammoxosomal membrane. (b) Proton motive force driven reversed electron transport combines central catabolism with nitrate reductase (NAR) to generate ferredoxin for carbon dioxide reduction in the acetyl CoA pathway. HAO, hydrazine oxidoreductase; HD, hydrazine dehydrogenase; HH, hydrazine hydrolase; NIR, nitrite oxidoreductase; Q, quinine. Light blue diamonds, cytochromes; blue arrows, reductions; pink arrows, oxidations. According to labeling experiments carried out in 1997, ammonium is biologically oxidized by hydroxylamine, most likely derived from nitrite, as the probable electron acceptor. The conversion of hydrazine to dinitrogen gas is hypothesized to be the reaction that generates the electron equivalents for the reduction of nitrite to hydroxylamine. In general, two possible reaction mechanisms are addressed:

One mechanism hypothesizes that a membrane bound enzyme complex converts ammonium and hydroxylamine to hydrazine first, followed by the oxidation of hydrazine to dinitrogen gas in the periplasm. At the same time, nitrite is reduced to hydroxylamine at the cytoplasmic site of the same enzyme complex responsible for hydrazine oxidation with an internal electron transport (Figure 3a). The other mechanism postulates the following: ammonium and hydroxylamine are converted to hydrazine by a membrane bound enzyme complex, hydrazine is oxidized in the periplasm to dinitrogen gas, and the generated electrons are transferred via an electron transport chain to nitrite reducing enzyme in the cytoplasm where nitrite is reduced to hydroxylamine (Figure 3b). Whether the reduction of nitrite and the oxidation of hydrazine occur at different sites of the same enzyme or the reactions are catalyzed by different enzyme systems connected via an electron transport chain remains to be investigated. Hydrazine has been proposed as an enzyme bound intermediate in the nitrogenase reaction. Recently, using detailed molecular analyses and combining complementary methods, Kartal and coworkers published strong evidence supporting the latter mechanism. Furthermore, the enzyme producing hydrazine, hydrazine synthase was purified and shown to produce hydrazine from NO and ammonium. A possible role of nitric oxide (NO) or nitroxyl (HNO) in anammox was proposed by Hooper et al. by way of condensation of NO or HNO and ammonium on an enzyme related to the ammonium monooxygenase family. The formed hydrazine or imine could subsequently be converted by the enzyme hydroxylamine oxidase to dinitrogen gas, and the reducing equivalents produced in the reaction are required to combine NO or HNO and ammonium or to reduce nitrite to NO. Environmental genomics analysis of the species Candidatus Kuenenia stuttgartiensis, through a slightly different and complementary metabolism mechanism, suggested NO to be the intermediate instead of hydroxylamine (Figure 4). However, this hypothesis also agreed that hydrazine was an important intermediate in the process. In this pathway (Figure 4), there are two enzymes unique to anammox bacteria: hydrazine synthase (hzs) and hydrazine dehydrogenase (hdh). The HZS produces hydrazine from nitric oxide and ammonium, and HDH transfer the electrons from hydrazine to ferredoxin. Few new genes, such as some known fatty acid biosynthesis and S adenosylmethionine radical enzyme genes, containing domains involved in electron transfer and catalysis have been detected. Another, still unexplored, reaction mechanism involves anaerobic ammonium oxidation on anodes of bio electrical systems. Such systems can be microbial fuel cells or microbial electrolysis cells. In the absence of dissolved oxygen, nitrite, or nitrate, microbes living in the anode compartment are able to oxidize ammonium to dinitrogen gas (N2) just as in the classical anammox process. At the same time, they unload the liberated electrons onto the anode, producing electrical current. This electrical current can be used either directly in fuel cell mode or for hydrogen and methane gas production in electrolysis mode. Anammoxoglobus, one species: A. propionicus. Jettenia, one species: J. asiatica. Scalindua, four species: S. brodae, S. sorokinii, S. wagneri, and S. profunda. Representatives of the first four genera were enriched from sludge from wastewater treatment plants; K. stuttgartiensis, B. anammoxidans, B. fulgida, and A. propionicus were even obtained from the same inoculum. Scalindua dominates the marine environment, but is also found in some freshwater ecosystems and wastewater treatment plants. Together, these 10 species likely only represent a minute fraction of anammox biodiversity. For instance, there are currently over 2000 16S rRNA gene sequences affiliated with anammox bacteria that have been deposited to the Genbank (https://www. ncbi. nlm. nih. gov/genbank/), representing an overlooked continuum of species, subspecies, and strains, each apparently having found its specific niche in the wide variety of habitats where anammox bacteria are encountered. Species microdiversity is particularly impressive for the marine representative Scalindua. A question that remains to be investigated is which environmental factors determine species differentiation among anammox bacteria. The sequence identities of the anammox 16S rRNA genes range from 87 to 99%, and phylogenetic analysis places them all within the phylum Planctomycetota, which form the PVC superphylum together with Verrucomicrobia and Chlamydiae. Within the Planctomycetota, anammox bacteria deeply branch as a monophyletic clade. Their phylogenetic position together with a broad range of specific physiological, cellular, and molecular traits give anammox bacteria their own order Brocadiales.

Преимущества

Обычное удаление азота из сточных вод, богатых аммиаком, осуществляется в два отдельных этапа: нитрификация, которая опосредуется аэробными аммиако- и нитритоокисляющими бактериями, и деннитрификация, осуществляемая деннитрификаторами, которые восстанавливают нитрат до азота с использованием подходящих доноров электронов. Аэрация и внесение органических субстратов (обычно метанола) показывают, что эти два процесса:

* Энергоемки.
* Связаны с образованием избыточного осадка.
* Производят значительное количество парниковых газов, таких как и N2O, а также озоноразрушающего NO.

Поскольку бактерии анамокса преобразуют аммоний и нитрит непосредственно в азот анаэробно, этот процесс не требует аэрации и других доноров электронов. Тем не менее, кислород все еще необходим для производства нитрита аммиакоокисляющими бактериями. Однако в системах частичной нитрификации/анаммокса потребность в кислороде значительно снижается, поскольку только половина аммония должна окисляться до нитрита, а не полностью до нитрата. Автотрофная природа бактерий анамокса и аммиакоокисляющих бактерий гарантирует низкий выход биомассы и, следовательно, меньшее образование осадка. В целом было показано, что эффективное применение процесса анамокса в очистке сточных вод приводит к снижению затрат до 60%, а также к снижению выбросов. Это затрудняет выращивание достаточного количества осадка для реактора очистки сточных вод. Кроме того, время восстановления после потери осадка в результате аварии больше, чем в традиционных системах удаления азота. С другой стороны, эта медленная скорость роста является преимуществом из-за сокращения избыточного осадка, который необходимо удалять и обрабатывать. В зависимости от конкретного вида оптимальный уровень pH составляет 8. Поэтому может потребоваться корректировать pH сточных вод путем добавления щелочи.