Введение
Метод переноса крупных биомолекул на носитель для анализа
В молекулярной биологии и генетике блот – это метод переноса крупных биомолекул (белков, ДНК или РНК) на носитель, такой как мембрана из нитроцеллюлозы, поливинилиденфторида или нейлона. В большинстве случаев это выполняется после электрофореза в геле, при котором молекулы переносятся из геля на блот-мембрану, а иногда образцы наносятся непосредственно на мембрану. После переноса, перенесенные молекулы визуализируются с помощью окрашивания красителями (например, серебряное окрашивание белков), авторадиографической визуализации радиоактивно меченых молекул (которая выполняется до переноса) или специфической метки некоторых белков или нуклеиновых кислот. Последнее достигается с помощью антител или гибридизационных зондов, которые связываются только с определенными молекулами на блоте и содержат присоединенный фермент. После тщательной промывки, эта ферментативная активность (и, следовательно, молекулы, присутствующие на блоте) визуализируется путем инкубации с соответствующим реагентом, что приводит к образованию цветного осадка на блоте или хемилюминесцентной реакции, регистрируемой на фотопленке.
Южный блот
Южный блот – это метод, регулярно используемый в молекулярной биологии для обнаружения конкретной последовательности ДНК в образцах ДНК. Южный блоттинг включает перенос разделенных электрофорезом фрагментов ДНК на фильтр-мембрану и последующее выявление фрагментов посредством гибридизации с помощью зонда.
Западный блот
Вестерн-блот используется для обнаружения специфических белков в сложных образцах. Белки сначала разделяют по размеру с помощью электрофореза, после чего переносят на подходящую матрицу для блоттинга (обычно поливинилиденфторид или нитроцеллюлоза) и затем обнаруживают с помощью антител.
Дальневосточный пятно
Подобно вестерн-блоту, фар-вестерн-блот использует взаимодействие белок-белок для обнаружения присутствия специфического белка, иммобилизованного на матрице для блоттинга. Затем антитела используются для обнаружения белково-белкового комплекса, что делает фар-вестерн-блот частным случаем вестерн-блота.
Юго-западный блот
Юго-западный блот основан на южном блоте и используется для идентификации и характеристики ДНК-связывающих белков по их способности связываться со специфическими олигонуклеотидными зондами. Белки разделяются с помощью гелевого электрофореза и затем переносятся на нитроцеллюлозные мембраны, подобно другим видам блоттинга.
Восточный блот
Восточный блот используется для обнаружения специфических посттрансляционных модификаций белков. Белки разделяются с помощью гелевого электрофореза, после чего переносятся на матрицу для блоттинга, где посттрансляционные модификации выявляются с помощью специфических субстратов (токсин холеры, конканавалин, фосфомолибдат и т. д.) или антител.
Дальневосточный пятно
Дальневосточный блот предназначен для обнаружения липидно-связанных олигосахаридов. Высокоэффективная тонкослойная хроматография сначала используется для разделения липидов по физико-химическим свойствам, затем они переносятся на матрицу для блоттинга, прежде чем олигосахариды обнаруживаются специфическим связывающим белком (например, антителами или лектинами).
Северный блот
Северный блот используется для обнаружения специфических последовательностей РНК в сложных образцах. В методе северного блоттинга сначала разделяют образцы по размеру с помощью гелевого электрофореза, после чего переносят на блоттинговую мембрану и обнаруживают с помощью меченых РНК-зондов.
Обратный северный блот
Обратный северный блот отличается от северного и южного блоттинга тем, что сначала на матрицу для блоттинга иммобилизуется ДНК, а затем специфические последовательности обнаруживаются с помощью меченых РНК-зондов.
Пятнистый пятна
Точечный блот — это особый случай любого из вышеуказанных блотов, при котором аналит добавляется непосредственно на матрицу для блоттинга (и проявляется в виде "точки"), в отличие от разделения образца электрофорезом перед блоттингом.