Инфузория Тетрахимена: Жизненный цикл и особенности строения.

Введение

Род одноклеточных организмов

Тетрахимена, одноклеточный эукариот, является родом свободноживущих инфузорий. Род Тетрахимена – наиболее широко изучаемый представитель своего типа. Он способен производить, накапливать и реагировать на различные типы гормонов. Клетки тетрахимены могут распознавать как родственные, так и чужеродные клетки. Они также могут переключаться между комменсалистическим и патогенным способами существования. Они широко распространены в пресноводных озерах, прудах и ручьях.

Жизненный цикл

Жизненный цикл T. thermophila состоит из чередования асексуальных и сексуальных стадий. В богатой питательными средах, во время вегетативного роста, клетки размножаются бесполым путем посредством бинарного деления. Этот тип клеточного деления происходит в результате последовательности морфогенетических событий, приводящих к развитию дублированных наборов клеточных структур, по одному для каждой дочерней клетки. Только в условиях голодания клетки переходят к половой конъюгации, объединяясь и сливаясь с клеткой противоположного типа спаривания. У Tetrahymena существует семь типов спаривания, каждый из которых может спариваться с любым из остальных шести без предпочтения, но не с собой. Как и у большинства инфузорий, T. thermophila дифференцирует свой геном на два функционально различных типа ядер, каждое из которых используется на разных этапах жизненного цикла. Диплоидное микроядро зародышевой линии транскрипционно неактивно и играет роль только на стадиях полового размножения. Ядро зародышевой линии содержит 5 пар хромосом, кодирующих наследственную информацию, передаваемую от одного поколения к следующему. Во время половой конъюгации гаплоидные мейотические продукты микроядер обеих родительских клеток сливаются, образуя новое микро- и макроядро в клетках потомства. Половая конъюгация происходит, когда клетки, голодающие не менее 2 часов в среде с недостатком питательных веществ, встречаются с клеткой комплементарного типа спаривания. После непродолжительного периода костимуляции (~1 час) голодающие клетки начинают объединяться передними концами, формируя специализированную область мембраны, называемую конъюгационным мостиком. В этой зоне мостика формируются несколько сотен фузионных пор, обеспечивающих взаимный обмен белками, РНК и, в конечном итоге, мейотическим продуктом их микроядер. Весь этот процесс занимает около 12 часов при 30 °C, но еще больше времени при более низких температурах. Последовательность событий во время конъюгации представлена на сопутствующем рисунке. Более крупное полиплоидное макроядро транскрипционно активно, то есть его гены активно экспрессируются, и поэтому оно контролирует функции соматических клеток во время вегетативного роста. Полиплоидная природа макроядра заключается в том, что оно содержит приблизительно 200–300 автономно реплицирующихся линейных мини-хромосом ДНК. Эти мини-хромосомы имеют собственные теломеры и образуются в результате сайт-специфической фрагментации пяти исходных микронуклеарных хромосом во время полового развития. У T. thermophila каждая из этих мини-хромосом кодирует несколько генов и существует в количестве примерно 45–50 копий в макроядре. Исключением является мини-хромосома, кодирующая рДНК, которая значительно увеличена в количестве, существуя в количестве примерно 10 000 копий в макроядре. Поскольку макроядро делится амитозом во время бинарного деления, эти мини-хромосомы распределяются неравномерно между клональными дочерними клетками. Благодаря естественному или искусственному отбору этот метод разделения ДНК в соматическом геноме может привести к образованию клональных клеточных линий с различными макронуклеарными фенотипами, фиксированными для определенного признака, в процессе, называемом фенотипическим ассортиментом. Таким образом, полиплоидный геном может тонко настраивать свою адаптацию к условиям окружающей среды, приобретая полезные мутации на любой данной мини-хромосоме, репликация которой затем отбирается, или, наоборот, теряя мини-хромосому, накапливающую негативную мутацию. Однако макроядро передается от одной клетки к другой только в течение асексуальной, вегетативной стадии жизненного цикла, поэтому оно никогда не наследуется непосредственно половым потомством. Только полезные мутации, возникающие в микроядре зародышевой линии T. thermophila, передаются из поколения в поколение, но эти мутации никогда не будут отобраны в окружающей среде в родительских клетках, поскольку они не экспрессируются.

The life cycle of T. thermophila consists of an alternation between asexual and sexual stages. In nutrient rich media during vegetative growth cells reproduce asexually by binary fission. This type of cell division occurs by a sequence of morphogenetic events that results in the development of duplicate sets of cell structures, one for each daughter cell. Only during starvation conditions will cells commit to sexual conjugation, pairing and fusing with a cell of opposite mating type. Tetrahymena has seven mating types; each of which can mate with any of the other six without preference, but not its own. Typical of ciliates, T. thermophila differentiates its genome into two functionally distinct types of nuclei, each specifically used during the two different stages of the life cycle. The diploid germline micronucleus is transcriptionally silent and only plays a role during sexual life stages. The germline nucleus contains 5 pairs of chromosomes which encode the heritable information passed down from one sexual generation to the next. During sexual conjugation, haploid micronuclear meiotic products from both parental cells fuse, leading to the creation of a new micro and macronucleus in progeny cells. Sexual conjugation occurs when cells starved for at least 2hrs in a nutrient depleted media encounter a cell of complementary mating type. After a brief period of co stimulation (~1hr), starved cells begin to pair at their anterior ends to form a specialized region of membrane called the conjugation junction. It is at this junctional zone that several hundred fusion pores form, allowing for the mutual exchange of protein, RNA and eventually a meiotic product of their micronucleus. This whole process takes about 12 hours at 30 °C, but even longer than this at cooler temperatures. The sequence of events during conjugation is outlined in the accompanying figure. The larger polyploid macronucleus is transcriptionally active, meaning its genes are actively expressed, and so it controls somatic cell functions during vegetative growth. The polyploid nature of the macronucleus refers to the fact that it contains approximately 200–300 autonomously replicating linear DNA mini chromosomes. These minichromosomes have their own telomeres and are derived via site specific fragmentation of the five original micronuclear chromosomes during sexual development. In T. thermophila each of these minichromosomes encodes multiple genes and exists at a copy number of approximately 45 50 within the macronucleus. The exception to this is the minichromosome encoding the rDNA, which is massively upregulated, existing at a copy number of approximately 10,000 within the macronucleus. Because the macronucleus divides amitotically during binary fission, these minichromosomes are un equally divided between the clonal daughter cells. Through natural or artificial selection, this method of DNA partitioning in the somatic genome can lead to clonal cell lines with different macronuclear phenotypes fixed for a particular trait, in a process called phenotypic assortment. In this way, the polyploid genome can fine tune its adaptation to environmental conditions through gain of beneficial mutations on any given mini chromosome whose replication is then selected for, or conversely, loss of a minichromosome which accrues a negative mutation. However, the macronucleus is only propagated from one cell to the next during the asexual, vegetative stage of the life cycle, and so it is never directly inherited by sexual progeny. Only beneficial mutations that occur in the germline micronucleus of T. thermophila are passed down between generations, but these mutations would never be selected for environmentally in the parental cells because they are not expressed.

Поведение

Свободно плавающие клетки Тетрагимены привлекаются к определенным химическим веществам посредством хемокинеза. Основными хемоаттрактантами являются пептиды и/или белки. Исследование 2016 года показало, что культивируемые Тетрагимены способны "запоминать" форму и размер пространства для плавания. Было обнаружено, что клетки, ограниченные в капле воды на короткое время, после освобождения повторяли циркулярные траектории плавания, "запомненные" в капле. Диаметр и продолжительность этих траекторий отражали размер капли и время, отведенное на адаптацию.

Ремонт ДНК

Среди протистов часто встречается, что половой цикл индуцируется стрессовыми условиями, такими как голодание. Эти условия часто приводят к повреждению ДНК. Центральной особенностью мейоза является гомологичная рекомбинация между несестринскими хромосомами. У *T. thermophila* этот процесс мейотической рекомбинации может быть полезен для восстановления повреждений ДНК, вызванных голоданием. Воздействие ультрафиолетового излучения на *T. thermophila* привело к более чем стократному увеличению экспрессии гена *Rad51*. Обработка алкилирующим агентом ДНК метилметансульфонатом также привела к значительному повышению уровня белка Rad51. Эти данные позволяют предположить, что цилиаты, такие как *T. thermophila*, используют рекомбинационный путь, зависимый от Rad51, для восстановления поврежденной ДНК. Рекомбиназа Rad51 *T. thermophila* является гомологом рекомбиназы RecA *Escherichia coli*. У *T. thermophila* Rad51 участвует в гомологичной рекомбинации во время митоза, мейоза и в восстановлении двухцепочечных разрывов ДНК. Во время конъюгации Rad51 необходим для завершения мейоза. Мейоз у *T. thermophila*, по-видимому, использует путь, зависимый от Mus81, который не использует синаптонемальный комплекс и считается вторичным у большинства других модельных эукариот. Этот путь включает резюльвазу Mus81 и геликазу Sgs1. Геликаза Sgs1, по-видимому, способствует некроссинговым результатам мейотического рекомбинационного восстановления ДНК, пути, который генерирует небольшое генетическое разнообразие.

Фенотипическая и генотипическая пластичность

Известно, что многие виды тетрагимен демонстрируют уникальные механизмы ответа на стресс и различные факторы окружающей среды. Уникальная геномная архитектура цилиат (наличие MIC, высокая плоидность, большое число хромосом и т.д.) обеспечивает дифференциальную экспрессию генов, а также повышенную геномную гибкость. Ниже представлен неполный список примеров фенотипической и генотипической пластичности у видов рода Tetrahymena.

Индуцируемые трофические полиморфизмы

T. vorax известен своим индуцируемым трофическим полиморфизмом – экологически агрессивной тактикой, позволяющей ему изменять стратегию питания и диету посредством изменения морфологии. Обычно T. vorax представляет собой бактериоядный микростом длиной около 60 мкм. Однако он способен превращаться в плотоядный макростом длиной около 200 мкм, способный питаться более крупными конкурентами. Если клетки T. vorax испытывают слишком сильный дефицит питательных веществ для осуществления трансформации, было также зафиксировано их превращение в третью, "хвостатую" микростомную форму, предположительно являющуюся защитным механизмом в ответ на каннибалистическое давление. Хотя T. vorax является наиболее изученной тетрахименой, демонстрирующей индуцируемый трофический полиморфизм, многие менее известные виды также способны к трансформации, включая T. paulina и T. paravorax. Однако только у T. vorax зарегистрированы как макростома, так и хвостатая микростома. Эти морфологические переключения запускаются избытком стоматина в окружающей среде – смесью метаболических соединений, выделяемых конкурирующими видами, такими как Paramecium, Colpidium и другими Tetrahymena. В частности, хроматографический анализ показал, что железо, гипоксантин и урацил являются химическими веществами в стоматине, ответственными за инициирование морфологических изменений. Многие исследователи указывают на "условия голодания" как на индуктор трансформации, поскольку в природе концентрация соединений-индукторов максимальна после того, как микростомальные цилиаты выедают бактериальные популяции, а популяции цилиат высоки. При высокой концентрации химических индукторов клетки T. vorax трансформируются с более высокой скоростью, что позволяет им охотиться на своих бывших трофических конкурентов. Точные генетические и структурные механизмы, лежащие в основе трансформации T. vorax, остаются неизвестными. Однако был достигнут определенный прогресс в идентификации генов-кандидатов. Исследователи из Университета Алабамы использовали вычитание кДНК для удаления активно транскрибируемой ДНК из микростомовых и макростомовых клеток T. vorax, оставив только дифференциально транскрибированные молекулы кДНК. Было обнаружено девять генов, специфичных для дифференцировки, при этом наиболее часто экспрессируемым геном-кандидатом оказалась новая последовательность – SUBII TG. Секвенированная область SUBII TG имеет длину 912 п.н. и состоит из трех в основном идентичных открытых рамок считывания длиной 105 п.н. Анализ нотерн-блота показал, что низкие уровни транскрипции обнаруживаются в микростомовых клетках, а высокие – в макростомовых. Кроме того, когда исследователи ограничили экспрессию SUBII TG в присутствии стоматина (с использованием антисмысловых олигонуклеотидных методов), снижение уровня мРНК SUBII TG на 55% коррелировало со снижением трансформации на 51%, что подтверждает предположение о том, что ген, по крайней мере частично, отвечает за контроль трансформации в T. vorax. Однако о гене SUBII TG известно очень мало. Исследователи смогли секвенировать лишь часть всей открытой рамки считывания, а другие гены-кандидаты изучены недостаточно. Секвенирование мРНК и аминокислот указывает на то, что убиквитин может играть важную роль в обеспечении трансформации. Однако в T. vorax не было идентифицировано известных генов семейства убиквитина. Наконец, генетические механизмы, лежащие в основе "хвостатой" микростома формы, остаются полностью неизвестными.

T. vorax is known for its inducible trophic polymorphisms, an ecologically offensive tactic that allows it to change its feeding strategy and diet by altering its morphology. Normally, T. vorax is a bacterivorous microstome around 60 μm in length. However, it has the ability to switch into a carnivorous macrostome around 200 μm in length that can feed on larger competitors. If T. vorax cells are too nutrient starved to undertake transformation, they have also been recorded as transforming into a third "tailed" microstome morph, thought to be a defense mechanism in response to cannibalistic pressure. While T. vorax is the most well studied Tetrahymena that exhibits inducible trophic polymorphisms, many lesser known species are able to undertake transformation as well, including T. paulina and T. paravorax. However, only T. vorax has been recorded as having both a macrostome and tailed microstome form. These morphological switches are triggered by an abundance of stomatin in the environment, a mixture of metabolic compounds released by competitor species, such as Paramecium, Colpidium, and other Tetrahymena. Specifically, chromatographic analysis has revealed that ferrous iron, hypoxanthine, and uracil are the chemicals in stomatin responsible for triggering the morphological change. Many researchers cite "starvation conditions" as inducing the transformation, as in nature, the compound inducers are in highest concentration after microstomal ciliates have grazed down bacterial populations, and ciliates populations are high. When the chemical inducers are in high concentration, T. vorax cells will transform at higher rates, allowing them to prey on their former trophic competitors. The exact genetic, and structural mechanisms that underlie T. vorax transformation are unknown. However, some progress has been made in identifying candidate genes. Researchers from the University of Alabama have used cDNA subtraction to remove actively transcribed DNA from microstome and macrostome T. vorax cells, leaving only differentially transcribed cDNA molecules. While nine differentiation specific genes were found, the most frequently expressed candidate gene was identified as a novel sequence, SUBII TG. The sequenced region of SUBII TG was 912 bp long and consists of three largely identical 105 bp open reading frames. A northern blot analysis revealed that low levels of transcription are detected in microstome cells, while high levels of transcription occur in macrostome cells. Furthermore, when the researchers limited SUBII TG expression in the presence of stomatin (using antisense oligonucleotide methods), a 55% reduction in SUBII TG mRNA correlated with a 51% decrease in transformation, supporting the notion that the gene is at least partially responsible for controlling the transformation in T. vorax. However, very little is known about the SUBII TG gene. Researchers were only able to sequence a portion of the entire open reading frame, and other candidate genes have not been investigated thoroughly. mRNA and amino acid sequencing indicate that ubiquitin may play a crucial role in allowing transformation to take place as well. However, no known genes in the ubiquitin family have been identified in T. vorax. Finally, the genetic mechanisms of the "tailed" microstome morph are completely unknown.

Устойчивость к металлам, усиливание генов и генома

Другие родственные виды демонстрируют собственные уникальные реакции на различные стрессоры. У *T. thermophila* амплификация хромосом и экспансия генов являются индуцируемыми ответами на распространенные органометаллические загрязнители, такие как кадмий, медь и свинец. Было обнаружено, что штаммы *T. thermophila*, подвергавшиеся длительному воздействию больших количеств Cd2+, имели 5-кратное увеличение числа копий генов *MTT1* и *MTT3* (генов металлотионеина, кодирующих белки, связывающие кадмий и свинец), а также гена *CNBDP* – не связанного с ними гена, расположенного непосредственно выше *MTT1* на той же хромосоме. Тот факт, что число копий гена, не являющегося металлотионеином, расположенного в том же локусе, что и *MTT1* и *MTT3*, увеличилось, указывает на то, что была амплифицирована вся хромосома, а не только отдельные гены. Виды рода *Tetrahymena* имеют 45-кратную плоидность макронуклеуса, что означает, что дикий тип *T. thermophila* обычно содержит 45 копий каждой хромосомы. Хотя точное число уникальных хромосом неизвестно, предполагается, что их около 187 в MAC и 5 в MIC. Таким образом, штамм, адаптированный к Ca2+, содержал 225 копий рассматриваемой специфической хромосомы. Это привело к почти 28-кратному увеличению обнаруженных уровней экспрессии *MTT1* и несколько меньшему увеличению экспрессии *MTT3*. Интересно, что когда исследователи выращивали образец популяции *T. thermophila* в обычной среде (без Cd2+) в течение 1 месяца, число копий генов *MTT1*, *MTT3* и *CNBDP* уменьшилось в среднем до 3 (135C). К 7 месяцам в обычной среде клетки *T. thermophila* вернулись к числу копий, характерному для дикого типа (45C). Когда исследователи вернули клетки из той же колонии в среду, содержащую Cd2+, в течение недели число копий генов *MTT1*, *MTT3* и *CNBDP* снова увеличилось до 3 (135C). Таким образом, авторы утверждают, что амплификация хромосом является индуцируемым и обратимым механизмом в генетическом ответе *Tetrahymena* на стресс, вызванный тяжелыми металлами. Исследователи также использовали эксперименты по подавлению экспрессии генов, в ходе которых число копий другого гена металлотионеина, расположенного на другой хромосоме (*MTT5*), было значительно уменьшено. В течение недели было обнаружено, что новый штамм развил 4 новых гена, возникших в результате, по крайней мере, одной дупликации *MTT1*. Однако дупликации хромосом не произошло, что подтверждается плоидностью, характерной для дикого типа, и нормальным количеством других генов на тех же хромосомах. Скорее, исследователи полагают, что дупликация произошла в результате событий гомологической рекомбинации, в результате чего образовались транскрипционно активные, повышенно экспрессируемые гены, несущие повторяющиеся последовательности *MTT1*.

Other related species exhibit their own unique responses to various stressors. In T. thermophila, chromosome amplification and gene expansion are inducible responses to common organometallic pollutants such as Cadmium, Copper, and Lead. Strains of T. thermophila that were exposed to large quantities of Cd2+ over time were found to have a 5 fold increase of MTT1, and MTT3 (metallothionein genes that code for Cadmium and Lead binding proteins) as well as CNBDP, an unrelated gene that lies just upstream of MTT1 on the same chromosome. The fact that a non metallothionein gene on the same locus as MTT1 and MTT3 increased copy number indicates that the entire chromosome had been amplified, as opposed to just specific genes. Tetrahymena species are 45 ploid for their macronucleus, meaning that the wild type of T. thermophila normally contains 45 copies of each chromosome. While the actual number of unique chromosomes are unknown, the number is thought to be around 187 in the MAC, and 5 in the MIC. Thus, the Ca2+ adapted strain contained 225 copies of the specific chromosome in question. This resulted in a nearly 28 times increase in detected expression levels of MTT1, and slightly less in MTT3. Interestingly, when researchers grew a sample of the T. thermophila population in normal growth medium (lacking Cd2+) for 1 month, the number of MTT1, MTT3, and CNBDP genes decreased to an average of 3 copies (135C). By 7 months in normal growth medium, the T. thermophila cells were found reduced to just the wild type copy number (45C). When researchers returned cells from the same colony to Cd2+ medium, within a week MTT1, MTT3, and CNBDP genes increased to 3 copies once again (135C). Thus, the authors argue that chromosome amplification is an inducible and reversible mechanism in the Tetrahymena genetic response to metal stress. Researchers also used gene knockdown experiments, where the copy number of another metallothionein gene on a different chromosome, MTT5, was dramatically reduced. Within a week, the new strain was found to have developed 4 novel genes from at least 1 duplication of MTT1. However, chromosome duplication had not taken place, as indicated by the wild type ploidy and the normal quantity of other genes on the same chromosomes. Rather, researchers believe that the duplication resulted from homologous recombination events, producing transcriptionally active, upregulated genes that carry repeated MTT1.

Улучшение подвижности и рассеяния

T. thermophila также претерпевает фенотипические изменения при ограниченной доступности ресурсов. Клетки способны изменять свою форму и размер, а также стратегии плавания в ответ на голодание. Более подвижные клетки, меняющиеся в ответ на голод, известны как дисперсеры, или дисперсерные клетки. Хотя скорость и степень фенотипических изменений различаются между штаммами, дисперсерные клетки формируются почти во всех штаммах T. thermophila при голодании. Дисперсеры и недиспергирующие клетки значительно уменьшаются в толщине и размере, при этом увеличивается плотность базальных телец и ресничек, что позволяет им плавать в 2-3 раза быстрее, чем обычные клетки. У некоторых штаммов T. thermophila также было обнаружено развитие одной, неработающей, увеличенной реснички, которая помогает клетке в управлении или направлении движения. Хотя было показано, что такое поведение коррелирует с более быстрым рассеянием и проявляется как обратимый признак в клетках тетрагимены, мало что известно о генетических или клеточных механизмах, обеспечивающих его развитие. Более того, другие исследования показали, что при голодании генетически разнообразных популяций T. thermophila дисперсерные клетки фактически увеличивались в длину, несмотря на одновременное уменьшение в толщине. Требуются дальнейшие исследования для определения генетических механизмов, лежащих в основе формирования дисперсеров.

Виды в роде

Виды этого рода включают. Группа разрабатывает самостоятельные лабораторные работы или уроки с использованием Tetrahymena в качестве обучающих модулей, которые учителя могут использовать на занятиях.