Яблочная дегидрогеназа: структура, функция и эволюция.

Введение

Класс ферментов

Малатодегидрогеназа (MDH) — фермент, который обратимо катализирует окисление малата до оксалоацетата, используя восстановление NAD+ до NADH. Эта реакция является частью многих метаболических путей, включая цикл трикарбоновых кислот. Другие малатодегидрогеназы, имеющие другие номера EC и катализирующие другие реакции окисления малата, имеют уточнённые названия, например, малатодегидрогеназа (NADP+).

Семейства белков

Семейство малатодегидрогеназ включает L-лактатдегидрогеназу и L-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназу. L-лактатдегидрогеназа катализирует превращение L-лактата в пируват, последний этап анаэробного гликолиза. N-конец представляет собой Rossmann-складку для связывания NAD, а C-конец – необычную альфа+бета-складку.

Эволюция и структура

В большинстве организмов малатодегидрогеназа (MDH) существует в виде гомодимерной молекулы и тесно связана по структуре с лактатдегидрогеназой (LDH). Это крупная молекула белка, состоящая из субъединиц весом от 30 до 35 кДа. На основании последовательностей аминокислот представляется, что MDH дивергировала в две основные филогенетические группы, которые тесно соответствуют митохондриальным изоферментам или цитоплазматическим/хлоропластным изоферментам. Поскольку идентичность последовательности малатодегидрогеназы в митохондриях более тесно связана с ее прокариотическими предками по сравнению с цитоплазматическим изозимом, теория о том, что митохондрии и хлоропласты развились в результате эндосимбиоза, представляется правдоподобной. Аминокислотные последовательности MDH архей более схожи с последовательностями LDH, чем с последовательностями MDH других организмов. Это указывает на возможную эволюционную связь между лактатдегидрогеназой и малатодегидрогеназой. Каждая субъединица димера малатодегидрогеназы имеет два различных домена, различающихся по структуре и функциональности. Параллельная β-структура образует домен связывания NAD+, в то время как центральный сайт связывания NAD+ состоит из четырех β-листов и одной α-спирали. Субъединицы удерживаются вместе за счет обширных водородных связей и гидрофобных взаимодействий. Также было показано, что малатодегидрогеназа содержит подвижный петлевой участок, играющий решающую роль в каталитической активности фермента. Исследования показали, что конформационное изменение этого петлевого участка из открытой конформации в закрытую после связывания субстрата усиливает катализ MDH за счет экранирования субстрата и каталитических аминокислот от растворителя. Также было установлено, что этот петлевой участок высоко консервативен в малатодегидрогеназе. С механистической точки зрения, малатодегидрогеназа катализирует окисление гидроксильной группы малата, используя NAD+ в качестве акцептора электронов. Этот этап окисления приводит к элиминированию протона и гидрид-иона из субстрата. NAD+ принимает гидрид-ион (в частности, гидрид-ион переносится на никотинамидное кольцо NAD+) и восстанавливается до NADH, в то время как остаток His 195 на ферменте одновременно принимает протон. Положительно заряженный остаток His 195, участвующий в основном катализе субстрата, стабилизируется соседним отрицательно заряженным остатком Asp 168. Эта электростатическая стабилизация способствует переносу протона. Исследования также выявили подвижный петлевой участок в малатодегидрогеназе, который участвует в каталитической активности фермента. Петля претерпевает конформационное изменение для защиты субстрата и каталитических аминокислот от растворителя в ответ на связывание комплекса малатодегидрогеназа:коэнзим с субстратом. Это переворачивание петли в верхнее положение для покрытия активного центра также способствует усилению взаимодействия каталитически важных аминокислотных остатков фермента с субстратом. Кроме того, было показано, что движение петли коррелирует с лимитирующей стадией скорости фермента.

In most organisms, malate dehydrogenase (MDH) exists as a homodimeric molecule and is closely related to lactate dehydrogenase (LDH) in structure. It is a large protein molecule with subunits weighing between 30 and 35 kDa. Based on the amino acid sequences, it seems that MDH has diverged into two main phylogenetic groups that closely resemble either mitochondrial isozymes or cytoplasmic/chloroplast isozymes. Because the sequence identity of malate dehydrogenase in the mitochondria is more closely related to its prokaryotic ancestors in comparison to the cytoplasmic isozyme, the theory that mitochondria and chloroplasts were developed through endosymbiosis is plausible. The amino acid sequences of archaeal MDH are more similar to that of LDH than that of MDH of other organisms. This indicates that there is a possible evolutionary linkage between lactate dehydrogenase and malate dehydrogenase. Each subunit of the malate dehydrogenase dimer has two distinct domains that vary in structure and functionality. A parallel β sheet structure makes up the NAD+ binding domain, while four β sheets and one α helix comprise the central NAD+ binding site. The subunits are held together through extensive hydrogen bonding and hydrophobic interactions. Malate dehydrogenase has also been shown to have a mobile loop region that plays a crucial role in the enzyme's catalytic activity. Studies have shown that conformational change of this loop region from the open conformation to the closed conformation after binding of substrate enhances MDH catalysis through shielding of substrate and catalytic amino acids from solvent. Studies have also indicated that this loop region is highly conserved in malate dehydrogenase. Mechanistically, malate dehydrogenase catalyzes the oxidation of the hydroxyl group of malate by utilizing NAD+ as an electron acceptor. This oxidation step results in the elimination of a proton and a hydride ion from the substrate. NAD+ receives the hydride ion (specifically, the hydride ion is transferred to the nicotinamide ring of the NAD+) and becomes reduced to NADH while concomitantly, the His 195 residue on the enzyme accepts the proton. The positively charged His 195 residue, which is involved in base catalysis of the substrate, is stabilized by the adjacent, negatively charged Asp 168 residue. This electrostatic stabilization helps facilitate the transfer of the proton. Studies have also identified a mobile loop in malate dehydrogenase that participates in the catalytic activity of the enzyme. The loop undergoes a conformational change to shield the substrate and catalytic amino acids from the solvent in response to the binding of the malate dehydrogenase:coenzyme complex to substrate. This flipping of the loop to the up position to cover the active site also promotes enhanced interaction of the catalytically important amino residues on the enzyme with the substrate. Additionally, the movement of the loop has been shown to correlate with the rate determining step of the enzyme.

Реакция

Малатодегидрогеназа катализирует обратимое превращение малата в оксалоацетат. В цикле лимонной кислоты малатодегидрогеназа отвечает за катализ регенерации оксалоацетата. Эта реакция происходит в результате окисления гидроксильной группы малата и восстановления NAD+. Механизм переноса гидрид-иона к NAD+ аналогичен механизму, наблюдаемому у лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы. Стандартное изменение свободной энергии Гиббса (ΔG'°) для малатодегидрогеназы составляет +29,7 кДж/моль, а изменение свободной энергии Гиббса в клетке (ΔG) – 0 кДж/моль.

Кинетическая

Кинетические исследования показывают, что ферментативная активность малатодегидрогеназы является упорядоченной. Кофактор NAD+/NADH связывается с ферментом перед субстратом. Константа Михаэлиса для малата, то есть концентрация, при которой активность фермента достигает половины максимальной, составляет 2 мМ. Значение Kcat равно 259,2 с−1.

Влияние pH на каталитическую активность

Кроме того, уровни pH контролируют специфичность связывания субстрата малатовой дегидрогеназой из-за переноса протонов в каталитическом механизме. Предполагается, что гистидиновый остаток с pK равным 7,5 играет роль в pH-зависимости фермента. Исследования показали, что связывание энольной формы оксалоацетата с комплексом малатовой дегидрогеназы и NADH происходит значительно быстрее при более высоких значениях pH.

Аллостерное регулирование

Поскольку малатодегидрогеназа тесно связана с циклом лимонной кислоты, исследования показали и экспериментально подтвердили, что цитрат является аллостерическим регулятором малатодегидрогеназы, зависящим от концентраций L-малата и NAD+. Это может быть обусловлено отклонениями в кинетическом поведении малатодегидрогеназы при высоких концентрациях оксалоацетата и L-малата. Эксперименты продемонстрировали, что цитрат способен как аллостерически активировать, так и ингибировать ферментативную активность малатодегидрогеназы. Показано, что цитрат ингибирует окисление L-малата при низких уровнях L-малата и NAD+. Однако в присутствии высоких уровней малата и NAD+ цитрат может стимулировать образование оксалоацетата. Хотя малатодегидрогеназа обычно рассматривается как обратимый фермент, предполагается наличие на ферменте аллостерического регуляторного центра, к которому может связываться цитрат, смещая равновесие реакции в любом направлении. Также было показано, что глутамат ингибирует активность малатодегидрогеназы. Более того, установлено, что альфа-кетоглутаратдегидрогеназа может взаимодействовать с митохондриальной аспартат-аминотрансферазой, образуя комплекс, который затем способен связываться с малатодегидрогеназой, формируя тройной комплекс, нейтрализующий ингибирующее действие глутамата на ферментативную активность малатодегидрогеназы. Кроме того, образование этого комплекса позволяет глутамату вступать в реакцию с аминотрансферазой, не вмешиваясь в активность малатодегидрогеназы. Формирование этого тройного комплекса также облегчает высвобождение оксалоацетата из малатодегидрогеназы в аминотрансферазу. Кинетически установлено, что связывание малатодегидрогеназы с бинарным комплексом альфа-кетоглутаратдегидрогеназы и аминотрансферазы увеличивает скорость реакции малатодегидрогеназы, поскольку Km малатодегидрогеназы снижается при ее связывании как части этого комплекса.