Полиакриламидный гель-электрофорез: принципы и применение.

Введение

Аналитический метод

Полиакриламидный гель-электрофорез (PAGE) – это широко используемый в биохимии, судебной химии, генетике, молекулярной биологии и биотехнологии метод разделения биологических макромолекул, обычно белков или нуклеиновых кислот, в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Электрофоретическая подвижность является функцией длины, конформации и заряда молекулы. Полиакриламидный гель-электрофорез – мощный инструмент для анализа образцов РНК. Денатурация полиакриламидного геля после электрофореза предоставляет информацию о составе образца РНК. Гидратация акрилонитрила приводит к образованию молекул акриламида (C3H5NO) под действием нитрилгидратазы. Мономер акриламида находится в порошкообразном состоянии до добавления воды. Акриламид токсичен для нервной системы человека, поэтому при работе с ним необходимо соблюдать все меры предосторожности. Акриламид растворим в воде и при добавлении инициаторов свободных радикалов полимеризуется с образованием полиакриламида. Сравнивая относительное отношение расстояния, пройденного каждым белком, к длине геля (Rf), можно сделать выводы об относительной молекулярной массе белков, где длина геля определяется расстоянием, пройденным малой молекулой, такой как индикаторный краситель. Для нуклеиновых кислот наиболее часто используемым денатурирующим агентом является мочевина. Для белков додецилсульфат натрия (SDS) – анионное моющее средство, добавляемое к белковым образцам для покрытия белков и придания им двух отрицательных зарядов (от каждой молекулы SDS) на каждые две аминокислоты денатурированного белка. Использование как нативного, так и SDS-PAGE в совокупности позволяет очищать и разделять различные субъединицы белка. Нативный PAGE сохраняет олигомерную форму белка и показывает полосу на геле, отражающую уровень его активности. SDS-PAGE денатурирует и разделяет олигомерную форму на мономеры, показывая полосы, соответствующие их молекулярным массам. Эти полосы можно использовать для идентификации и оценки чистоты белка. Помимо SDS, белки могут быть дополнительно кратковременно нагреты почти до кипения в присутствии восстановителя, такого как дитиотреитол (DTT) или 2-меркаптоэтанол (бета-меркаптоэтанол/BME), который дополнительно денатурирует белки, восстанавливая дисульфидные связи, тем самым преодолевая некоторые формы третичной структуры белка и разрушая четвертичную структуру белка (олигомерные субъединицы). Это называется восстанавливающим SDS-PAGE. В раствор может быть добавлен индикаторный краситель, который обычно обладает более высокой электрофоретической подвижностью, чем анализируемые вещества, что позволяет экспериментатору отслеживать продвижение раствора через гель во время электрофореза.

Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) is a technique widely used in biochemistry, forensic chemistry, genetics, molecular biology and biotechnology to separate biological macromolecules, usually proteins or nucleic acids, according to their electrophoretic mobility. Electrophoretic mobility is a function of the length, conformation, and charge of the molecule. Polyacrylamide gel electrophoresis is a powerful tool used to analyze RNA samples. When polyacrylamide gel is denatured after electrophoresis, it provides information on the sample composition of the RNA species. Hydration of acrylonitrile results in formation of acrylamide molecules (|C3H5NO) by nitrile hydratase. Acrylamide monomer is in a powder state before addition of water. Acrylamide is toxic to the human nervous system, therefore all safety measures must be followed when working with it. Acrylamide is soluble in water and upon addition of free radical initiators it polymerizes resulting in formation of polyacrylamide. By comparing the relative ratio of the distance traveled by each protein to the length of the gel (Rf) one can make conclusions about the relative molecular weight of the proteins, where the length of the gel is determined by the distance traveled by a small molecule like a tracking dye. For nucleic acids, urea is the most commonly used denaturant. For proteins, sodium dodecyl sulfate (SDS) is an anionic detergent applied to protein samples to coat proteins in order to impart two negative charges (from every SDS molecule) to every two amino acids of the denatured protein. Procedurally, using both Native and SDS PAGE together can be used to purify and to separate the various subunits of the protein. Native PAGE keeps the oligomeric form intact and will show a band on the gel that is representative of the level of activity. SDS PAGE will denature and separate the oligomeric form into its monomers, showing bands that are representative of their molecular weights. These bands can be used to identify and assess the purity of the protein. In addition to SDS, proteins may optionally be briefly heated to near boiling in the presence of a reducing agent, such as dithiothreitol (DTT) or 2 mercaptoethanol (beta mercaptoethanol/BME), which further denatures the proteins by reducing disulfide linkages, thus overcoming some forms of tertiary protein folding, and breaking up quaternary protein structure (oligomeric subunits). This is known as reducing SDS PAGE. A tracking dye may be added to the solution. This typically has a higher electrophoretic mobility than the analytes to allow the experimenter to track the progress of the solution through the gel during the electrophoretic run.

Приготовление гелей акриламида

Гели обычно состоят из акриламида, бисакриламида, опционального денатурирующего агента (SDS или мочевины) и буфера с отрегулированным pH. Раствор можно дегазировать под вакуумом для предотвращения образования пузырьков воздуха во время полимеризации. В качестве альтернативы, бутанол можно добавить в гель для разделения (для белков) после заливки, так как бутанол удаляет пузырьки и выравнивает поверхность. Для инициирования полимеризации добавляют источник свободных радикалов и стабилизатор, такие как персульфат аммония и TEMED. Реакция полимеризации приводит к образованию геля благодаря добавленному бисакриламиду, который способен формировать поперечные связи между двумя молекулами акриламида. Соотношение бисакриламида к акриламиду может варьироваться для специальных целей, но обычно составляет примерно 1 часть к 35. Концентрацию акриламида в геле также можно изменять, обычно в диапазоне от 5% до 25%. Гели с более низкой концентрацией лучше подходят для разделения молекул с очень высокой молекулярной массой, в то время как для разделения меньших белков требуется значительно более высокая концентрация акриламида. Средний диаметр пор полиакриламидных гелей определяется общей концентрацией акриламидов (% T, где T = общая концентрация акриламида и бисакриламида) и концентрацией сшивающего агента бисакриламида (% C, где C = концентрация бисакриламида). Размер пор уменьшается обратно пропорционально % T. Что касается % C, то концентрация 5% создает наименьшие поры, поскольку влияние бисакриламида на размер пор имеет форму параболы с вершиной в 5%. Гели обычно полимеризуют между двумя стеклянными пластинами в форме для гелей, с вставленным сверху гребнем для формирования лунок для образцов. После полимеризации геля гребень можно удалить, и гель готов к электрофорезу.

Электрофорез

В PAGE используются различные буферные системы в зависимости от природы образца и цели эксперимента. Буферы, используемые на аноде и катоде, могут быть одинаковыми или различными. К гелю прикладывается электрическое поле, в результате чего отрицательно заряженные белки или нуклеиновые кислоты мигрируют через гель от отрицательного электрода (который является катодом, поскольку это электролитическая, а не гальваническая ячейка) к положительному электроду (аноду). В зависимости от размера, каждая биомолекула по-разному перемещается в гелевой матрице: небольшие молекулы легче проходят через поры геля, а более крупные испытывают большее сопротивление. Обычно гель прогоняют в течение нескольких часов, хотя это зависит от приложенного напряжения; миграция происходит быстрее при более высоком напряжении, но результаты, как правило, менее точны, чем при более низком напряжении. По истечении заданного времени биомолекулы мигрируют на разные расстояния в зависимости от их размера. Меньшие биомолекулы проходят дальше по гелю, а более крупные остаются ближе к точке начала. Таким образом, биомолекулы могут быть разделены приблизительно по размеру, который в условиях денатурации в основном зависит от молекулярной массы, а в нативных условиях – также от конформации высшего порядка. Подвижность в геле определяется как скорость миграции при градиенте напряжения 1 В/см и измеряется в см²/сек/В. Для аналитических целей относительная подвижность биомолекул, Rf – отношение расстояния, пройденного молекулой в геле, к общему расстоянию, пройденному индикаторным красителем – наносится на график в зависимости от молекулярной массы молекулы (или иногда от логарифма молекулярной массы, точнее, от молекулярного радиуса Mr). Такие обычно линейные графики представляют собой стандартные маркеры или калибровочные кривые, широко используемые для количественной оценки размеров различных биомолекул.

Дальнейшая обработка

После электрофореза гель может быть окрашен (для белков, чаще всего используют краситель Coomassie brilliant blue R 250 или авторадиографию; для нуклеиновых кислот – бромид этидия; или для обоих типов – серебряное окрашивание), что позволяет визуализировать разделенные белки, либо подвергнут дальнейшей обработке (например, вестерн-блоттинг). После окрашивания различные биомолекулы проявляются в виде отдельных полос в геле. Обычно для калибровки геля и приблизительной оценки молекулярной массы неизвестных биомолекул в отдельной полосе геля запускают маркеры молекулярной массы с известными значениями, сравнивая расстояние, пройденное анализируемыми образцами относительно маркеров. Для белков SDS-PAGE обычно является методом выбора для оценки чистоты благодаря своей надежности и простоте. Присутствие SDS и этап денатурации обеспечивают разделение белков преимущественно по размеру, однако у некоторых белков может наблюдаться аномальная миграция. Разные белки могут по-разному окрашиваться, что затрудняет количественную оценку по интенсивности окрашивания. PAGE также может использоваться как препаративный метод для очистки белков. Например, препаративная нативная PAGE применяется для разделения нативных металлопротеинов в сложных биологических матрицах.

Химические ингредиенты и их роль

Полиакриламидный гель (PAG) был известен как потенциальная среда для заливки образцов тканей для получения срезов уже в 1964 году, а две независимые группы использовали PAG в электрофорезе в 1959 году. Он обладает рядом электрофоретически ценных свойств, которые делают его универсальной средой. Это синтетический, термостабильный, прозрачный, прочный, химически относительно инертный гель, который можно приготовить с широким диапазоном средних размеров пор. Размер пор геля и воспроизводимость размера пор определяются тремя факторами: общим количеством присутствующего акриламида (%T) (T = общая концентрация акриламида и бисакриламида мономера), количеством сшивающего агента (%C) (C = концентрация бисакриламида) и временем полимеризации акриламида (см. QPNC PAGE). Размер пор уменьшается с увеличением %T; при сшивании 5%C обеспечивает наименьший размер пор. Любое увеличение или уменьшение %C от 5% приводит к увеличению размера пор, поскольку зависимость размера пор от %C является параболической функцией с вершиной в 5%C. Это, вероятно, связано с неоднородным уплотнением полимерных цепей внутри геля. Этот гелевый материал также выдерживает высокие градиенты напряжения, пригоден для различных процедур окрашивания и обесцвечивания, а также может быть подвергнут гидролизу для извлечения разделенных фракций или высушен для авторадиографии и постоянной регистрации.

Компоненты

Полиакриламидные гели состоят из геля для концентрирования и геля для разделения. Гели для концентрирования имеют более высокую пористость по сравнению с гелем для разделения и позволяют белкам мигрировать в концентрированной области. Кроме того, гели для концентрирования обычно имеют pH 6,8, поскольку нейтральные молекулы глицина обеспечивают более высокую подвижность белков. Гели для разделения имеют pH 8,8, где анионный глицин замедляет подвижность белков. Гели для разделения обеспечивают разделение белков и имеют относительно меньшую пористость. Здесь белки разделяются по размеру (в SDS-PAGE) и размеру/заряду (в нативном PAGE). Химический буфер стабилизирует значение pH до желаемого значения как в самом геле, так и в буфере для электрофореза. Выбор буфера также влияет на электрофоретическую подвижность буферных контрионов и, следовательно, на разрешение геля. Буфер также должен быть нереактивным и не модифицировать или вступать в реакцию с большинством белков. В зависимости от применения в качестве катодных и анодных буферов могут использоваться различные буферы. В одном геле могут быть использованы несколько значений pH, например, в электрофорезе DISC. Распространенные буферы в PAGE включают Tris, Bis-Tris или имидазол. Контрионы уравновешивают внутренний заряд буферного иона и также влияют на напряженность электрического поля во время электрофореза. Высокозаряженные и подвижные ионы часто избегают в катодных буферах SDS-PAGE, но могут быть включены в сам гель, где они мигрируют впереди белка. В таких приложениях, как DISC SDS-PAGE, значения pH в геле могут изменяться для изменения среднего заряда контрионов во время прогона с целью повышения разрешения. Популярными контрионами являются глицин и трицин. Глицин использовался в качестве источника замедляющего иона, поскольку его pKa равен 9,69, а подвижность глицината такова, что эффективная подвижность может быть установлена ниже значения самых медленных известных белков с чистым отрицательным зарядом в данном диапазоне pH. Минимальное значение pH в этом диапазоне составляет приблизительно 8,0. Акриламид (|C3H5NO; молекулярная масса: 71,08) при растворении в воде подвергается медленной, спонтанной автополимеризации, соединяя молекулы последовательно, образуя длинные полимерные цепи. Наличие системы, генерирующей свободные радикалы, значительно ускоряет полимеризацию. Этот тип реакции известен как полимеризация присоединением по виниловому типу. Раствор этих полимерных цепей становится вязким, но не образует гель, поскольку цепи просто скользят друг над другом. Для образования геля требуется сшивание различных цепей друг с другом. Акриламид является канцерогеном, нейротоксином и токсином для репродуктивной системы. Также необходимо хранить акриламид в прохладном, темном и сухом месте, чтобы уменьшить автополимеризацию и гидролиз. Бисакриламид (N,N'-метиленбисакриламид) (|C7H10N2O2; молекулярная масса: 154,17) является наиболее часто используемым сшивающим агентом для полиакриламидных гелей. Химически его можно рассматривать как две молекулы акриламида, соединенные «голова к голове» на их нереактивных концах. Бисакриламид может сшивать две полиакриламидные цепи друг с другом, тем самым образуя гель. Додецилсульфат натрия (SDS) (|C12H25NaO4S; молекулярная масса: 288,38) (используется только в денатурирующих гелях для белков) является сильным детергентом, используемым для денатурации нативных белков до отдельных полипептидов. Эта денатурация, называемая реконструктивной денатурацией, достигается не полной линеаризацией белка, а посредством конформационного изменения в комбинацию случайных клубков и α-спиральных вторичных структур. Бромид этидия связывается с цепями нуклеиновых кислот посредством интеркаляции. EtBr используется путем простого добавления его в гелевую смесь. После прогона геля его можно просмотреть с помощью системы фотодокументирования. Серебряное окрашивание было введено Кереньи и Галльясом как высокочувствительная процедура для обнаружения следовых количеств белков в гелях. Метод был расширен для изучения других биологических макромолекул, разделенных на различных носителях. Многие переменные могут влиять на интенсивность окраски, и каждый белок имеет свои собственные характеристики окрашивания; чистая стеклянная посуда, чистые реагенты и вода высочайшей чистоты являются ключевыми моментами для успешного окрашивания. Серебряное окрашивание было разработано в XIV веке для окрашивания поверхности стекла. Оно широко использовалось для этой цели с XVI века. Цвет, производимый ранними серебряными красителями, варьировался от светло-желтого до оранжево-красного. Камилло Гольджи усовершенствовал серебряное окрашивание для изучения нервной системы. Метод Гольджи окрашивает ограниченное число клеток случайным образом целиком. Авторадиография, также используемая для обнаружения белковых полос после электрофореза в геле, использует радиоактивные изотопы для мечения белков, которые затем обнаруживаются с помощью рентгеновской пленки. Вестерн-блоттинг — это процесс, при котором белки, разделенные в акриламидном геле, электрофоретически переносят на стабильную, удобную в обращении мембрану, такую как нитроцеллюлозная, нейлоновая или PVDF-мембрана. Затем можно применить иммунохимические методы для визуализации перенесенных белков, а также точно определить относительное увеличение или уменьшение интересующего белка.

Polyacrylamide gels are composed of a stacking gel and separating gel. Stacking gels have a higher porosity relative to the separating gel, and allow for proteins to migrate in a concentrated area. Additionally, stacking gels usually have a pH of 6.8, since the neutral glycine molecules allow for faster protein mobility. Separating gels have a pH of 8.8, where the anionic glycine slows down the mobility of proteins. Separating gels allow for the separation of proteins and have a relatively lower porosity. Here, the proteins are separated based on size (in SDS PAGE) and size/ charge (Native PAGE). Chemical buffer stabilizes the pH value to the desired value within the gel itself and in the electrophoresis buffer. The choice of buffer also affects the electrophoretic mobility of the buffer counterions and thereby the resolution of the gel. The buffer should also be unreactive and not modify or react with most proteins. Different buffers may be used as cathode and anode buffers, respectively, depending on the application. Multiple pH values may be used within a single gel, for example in DISC electrophoresis. Common buffers in PAGE include Tris, Bis Tris, or imidazole. Counterion balance the intrinsic charge of the buffer ion and also affect the electric field strength during electrophoresis. Highly charged and mobile ions are often avoided in SDS PAGE cathode buffers, but may be included in the gel itself, where it migrates ahead of the protein. In applications such as DISC SDS PAGE the pH values within the gel may vary to change the average charge of the counterions during the run to improve resolution. Popular counterions are glycine and tricine. Glycine has been used as the source of trailing ion or slow ion because its pKa is 9.69 and mobility of glycinate are such that the effective mobility can be set at a value below that of the slowest known proteins of net negative charge in the pH range. The minimum pH of this range is approximately 8.0. Acrylamide (|C3H5NO; mW: 71.08) when dissolved in water, slow, spontaneous autopolymerization of acrylamide takes place, joining molecules together by head on tail fashion to form long single chain polymers. The presence of a free radical generating system greatly accelerates polymerization. This kind of reaction is known as vinyl addition polymerisation. A solution of these polymer chains becomes viscous but does not form a gel, because the chains simply slide over one another. Gel formation requires linking various chains together. Acrylamide is carcinogenic, a neurotoxin, and a reproductive toxin. It is also essential to store acrylamide in a cool dark and dry place to reduce autopolymerisation and hydrolysis. Bisacrylamide (N,N′ Methylenebisacrylamide) (|C7H10N2O2; mW: 154.17) is the most frequently used cross linking agent for polyacrylamide gels. Chemically it can be thought of as two acrylamide molecules coupled head to head at their non reactive ends. Bisacrylamide can crosslink two polyacrylamide chains to one another, thereby resulting in a gel. Sodium dodecyl sulfate (SDS) (|C12H25NaO4S; mW: 288.38) (only used in denaturing protein gels) is a strong detergent agent used to denature native proteins to individual polypeptides. This denaturation, which is referred to as reconstructive denaturation, is not accomplished by the total linearization of the protein, but instead, through a conformational change to a combination of random coil and α helix secondary structures. Ethidium bromide binds nucleic acid chains through the process of Intercalation. EtBr is used by simply adding it to the gel mixture. Once the gel has run, the gel may be viewed through the use of a photo documentation system. Silver staining was introduced by Kerenyi and Gallyas as a sensitive procedure to detect trace amounts of proteins in gels. The technique has been extended to the study of other biological macromolecules that have been separated in a variety of supports. Many variables can influence the colour intensity and every protein has its own staining characteristics; clean glassware, pure reagents and water of highest purity are the key points to successful staining. Silver staining was developed in the 14th century for colouring the surface of glass. It has been used extensively for this purpose since the 16th century. The colour produced by the early silver stains ranged between light yellow and an orange red. Camillo Golgi perfected the silver staining for the study of the nervous system. Golgi's method stains a limited number of cells at random in their entirety. Autoradiography, also used for protein band detection post gel electrophoresis, uses radioactive isotopes to label proteins, which are then detected by using X ray film. Western blotting is a process by which proteins separated in the acrylamide gel are electrophoretically transferred to a stable, manipulable membrane such as a nitrocellulose, nylon, or PVDF membrane. It is then possible to apply immunochemical techniques to visualise the transferred proteins, as well as accurately identify relative increases or decreases of the protein of interest.