Введение
Метод диагностики
Окраска по Лейшману, также известная как окрашивание Лейшмана, используется в микроскопии для окрашивания мазков крови. Обычно применяется для дифференциации и идентификации лейкоцитов, малярийных паразитов и трипаносом. В её основе лежит метанольный раствор, содержащий "полихромированный" метиленовый синий (то есть деметилированный до различных азолов) и эозин. Метанольный исходный раствор стабилен и также выполняет функцию непосредственной фиксации мазка, исключая стадию префиксации. Если рабочий раствор приготавливается разбавлением водным буфером, полученная смесь крайне нестабильна и не может использоваться длительное время. Окраска по Лейшману названа в честь её изобретателя, шотландского патолога Уильяма Буга Лейшмана. Это разновидность окраски Романовского, поэтому она сходна с окрасками Гиемзы, Дженнера и Райта и в некоторой степени может быть заменена ими.
Приготовление и хранение
Многие компании продают краситель Лейшмана в виде сухого порошка, который затем восстанавливают метанолом. Тепло и яркий свет окисляют краситель и вызывают выпадение нерастворимых осадков, таких как соли метиленового фиолетового (Бернтсена) или азурного эозина.
Хороший контраст.
Окраска по Лейшману обычно демонстрирует яркий фиолетовый цвет ядра и гранул нейтрофилов, что облегчает дифференциальный подсчет и обеспечивает лучшее качество окрашивания по сравнению с простыми окрашиваниями на основе метиленового синего и эозина, которые не создают достаточного контраста между цитоплазмой и ядром. Поскольку окраска по Лейшману, как и другие красители Романовского, лучше выявляет детали и гранулы цитоплазмы, гематологи обычно отдают ей предпочтение (однако см. ниже информацию о цитологах). По сравнению с дорогостоящими и токсичными чистыми синтетическими реагентами на основе азура B и эозина Y, используемыми в референсных методах ICSH, которые также подвержены окислению и в конечном итоге дают серый оттенок вместо оптимального синего цвета цитоплазмы, окраска по Лейшману – это недорогой, легкодоступный и простой в исполнении метод, обеспечивающий вполне приемлемый контраст.
Хорошая чувствительность к малярийному паразиту
Документировано, что окраска по Лейшману более чувствительна, чем окраска по Филду, и столь же эффективна, как флуоресцентные красители для выявления малярийного паразита.
Трудность контроля молярного соотношения
Состав полихромного метиленового синего, смешанного с эозином, никогда не бывает таким же качественным, как при непосредственном взвешивании и смешивании компонентов в красителях типа Giemsa. Альберт Плен в 1890 году установил, что молярное соотношение основных красителей к кислотным необходимо было увеличить с 2:1 до 3:1, однако с 1899 года использование кристаллов Azure Eosinate вернуло это соотношение к неудовлетворительному 2:1, что привело к снижению интенсивности окраски. Лишь благодаря работам Густава Гиемса и его последователей, которые вновь стали вручную контролировать пропорции этих двух компонентов, удалось восстановить глубину окрашивания. Однако Гиемса и другие исследователи, искусственно контролируя пропорции, иногда доходили до противоположной крайности (значительный молярный избыток Azure, вплоть до соотношения 16,1), что, вероятно, было излишним. Согласно рекомендациям ICSH, оптимальное соотношение составляет от 6,5 до 7,3.
Нестабильность
Лейшманский краситель при восстановлении с буфером становится очень нестабильным (в отличие от красителя Giemsa, который относительно более стабилен благодаря глицерину, или референсных красителей ICSH, в которых используется метанол + ДМСО в соотношении 6:4 по объему), и начинает выпадать в осадок, требуя повторной фильтрации. Если не осуществлять тщательный контроль, поглощение воды, испарение метанола из открытой ёмкости и повторная фильтрация изменяют состав красителя, что требует его частой замены и делает метод неэкономичным. Если не проводить фильтрацию, осадок на мазке можно спутать с тромбоцитами. Важно не взбалтывать флакон с красителем перед использованием, иначе осевший осадок снова взвесится и будет откладываться на препаратах во время окрашивания, вызывая многочисленные артефакты и затрудняя микроскопию.
Цитоплазматический контраст хороший, но ядерный контраст не такой хороший, как H&E
Как и все другие методы Малаховского-Романовского-Гимзы, со временем выцветает и не подлежит длительному стабильному архивированию. Подобно другим методам, он окрашивает ядра в темно-фиолетовый цвет, при этом детали структуры ядра видны не так четко, как при окраске гематоксилином и эозином, что является причиной предпочтения этого метода некоторыми цитопатологами. Однако, он является дополнительным методом, поскольку лучше окрашивает детали цитоплазмы, такие как гранулы, по сравнению с гематоксилином и эозином.